Un derivado específico de la dispiropiperazina que detiene el ciclo celular, induce la apoptosis, la necrosis y el daño del ADN | Shijiazhuang Agile Peak Ventures Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8674 (2023) Citar este artículo

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Los compuestos de dispiropiperazina son una clase de moléculas que se sabe que confieren actividad biológica, pero las que se han estudiado como reguladores del ciclo celular son pocas. Aquí, informamos la caracterización y síntesis de dos derivados de la dispiropiperazina: la espiro[2′,3]-bis(acenafteno-1′-ona)perhidrodipirrolo-[1,2-a:1,2-d]-pirazina sintetizada previamente (SPOPP-3, 1), y su isómero no descrito previamente, espiro[2′,5′]-bis(acenafteno-1′-ona)perhidrodipirrolo-[1,2-a:1,2-d]-pirazina ( SPOPP-5, 2). Se demostró que SPOPP-3 (1), pero no SPOPP-5 (2), tiene actividad antiproliferativa contra un panel de 18 líneas celulares de cáncer humano con valores de IC50 que oscilan entre 0,63 y 13 µM. El análisis de citometría de flujo reveló que SPOPP-3 (1) pudo detener el ciclo celular en la fase G2/M en células cancerosas humanas SW480. El análisis de transferencia Western confirmó además que la detención del ciclo celular está en la fase M. Además, se demostró que SPOPP-3 (1) induce apoptosis, necrosis y daño en el ADN, así como también interrumpe el posicionamiento del huso mitótico en las células SW480. Estos resultados justifican una mayor investigación de SPOPP-3 (1) como un nuevo agente anticancerígeno, particularmente por su capacidad potencial para sensibilizar a las células cancerosas para la muerte celular inducida por radiación, mejorar la inmunoterapia contra el cáncer, superar la resistencia a los medicamentos relacionada con la apoptosis y para su posible uso. en tratamientos contra el cáncer de letalidad sintética.

El uso de productos químicos y radiación para inducir daños en el ADN es el método más utilizado para la terapia del cáncer. Recientemente, existe un mayor interés en la manipulación del ciclo celular para inducir una catástrofe mitótica como una nueva estrategia terapéutica contra el cáncer1,2,3,4,5. La catástrofe mitótica se caracteriza por células que normalmente se detendrían en la fase G2/M debido a daños en el ADN o en el huso mitótico, pero que en falso proceden a la mitosis debido a puntos de control del ciclo celular defectuosos6. El resultado final es la senescencia o muerte celular por apoptosis, necrosis o autofagia7. Esta estrategia se basa en el uso de agentes que dañan el ADN o radiación en combinación con inhibidores del punto de control del ciclo celular. De hecho, varios inhibidores del punto de control de la fase G2/M1,2,3,4,5, incluido el irinotecán, un fármaco quimioterapéutico utilizado actualmente para el cáncer colorrectal metastásico, han mostrado potencial para sensibilizar las células tumorales a la radiación ionizante. Como tal, el descubrimiento de nuevos compuestos que causen la detención del ciclo celular G2/M sigue siendo un área importante de la investigación del cáncer8,9,10.

Actualmente hay pocos derivados de dispiropiperazina biológicamente activos conocidos. Uno de los cuales es el cloruro de prospidium. Este compuesto, también conocido como prospidina, tiene propiedades citostáticas, antiinflamatorias e inmunosupresoras11,12,13. Se ha clasificado como un compuesto antineoplásico en función de su capacidad para inhibir la mitogénesis de las células T y B durante la transformación linfoblástica11 y para reducir los volúmenes tumorales de tumores mamarios inducidos por carcinógenos en ratas12. Actualmente, el cloruro de prospidio se utiliza como fármaco antirreumático en la artritis reumatoide refractaria14.

A pesar de informes previos de compuestos de dispiropiperazina biológicamente activos, no se han explorado suficientemente otros derivados químicos. Aquí informamos por primera vez la actividad antiproliferativa de la espiro[2′,3]-bis(acenafteno-1′-ona)perhidrodipirrolo-[1,2-a:1,2-d]-pirazina (SPOPP -3, 1), un derivado de la dispiropiperazina sintetizado previamente. SPOPP-3 (1) tiene actividad antiproliferativa contra un panel de líneas celulares de cáncer humano y es capaz de detener el ciclo celular en la fase G2/M e inducir apoptosis, necrosis y daño en el ADN, así como alterar el posicionamiento del huso mitótico.

Un informe reciente demostró la síntesis de dos derivados de la dispiropiperazina, espiro[2′,3]-bis(acenafteno-1′-ona)perhidrodipirrolo-[1,2-a:1,2-d]-pirazina (referido aquí como SPOPP-3, 1) y espiro[2′,5]-bis(acenafteno-1′-ona)perhidrodipirrolo-[1,2-a:1,2-d]-pirazina, a través de una reacción de cicloadición de iluro de azometina usando acenaftenequinona (AcQ) y l-prolina como sustratos15. Realizamos una reacción similar con ligeras modificaciones como se describe en "Materiales y métodos" para obtener SPOPP-3 (1) (Fig. 1). Sorprendentemente, también obtuvimos una pequeña cantidad de espiro[2′,5′]-bis(acenafteno-1′-ona)perhidrodipirrolo-[1,2-a:1,2-d]-pirazina (referida aquí como SPOPP -5, 2) (Fig. 1 y Figs. complementarias S2, S3, S6–S11), un isómero que no se ha aislado previamente debido a su vía de formación desfavorable prevista15,16. Aquí, informamos por primera vez, la pureza (Figura complementaria S2) y la estructura de SPOPP-5 (2) según lo determinado por FTIR (Figura complementaria S3), RMN (Figuras complementarias S6–S10) y rayos X. análisis de difracción (Fig. S11 complementaria).

Síntesis de los derivados de dispiropiperazina SPOPP-3 (1) y SPOPP-5 (2).

Hasta donde sabemos, no se ha informado de bioactividad para SPOPP-3 (1). En este documento, mostramos por primera vez que SPOPP-3 (1) redujo significativamente la viabilidad celular en células de cáncer de colon humano (Fig. 2). Para SPOPP-3 (1), la IC50 fue de 5,06 ± 1,43 µM, 5,42 ± 0,96 µM y 2,44 ± 0,83 µM en células de cáncer de colon humano SW480, HT29 y HCT116 respectivamente (Tabla 1). Por el contrario, su isómero SPOPP-5 (2) no tuvo un efecto significativo, con IC50 > 100 µM (Fig. 2; Tabla 1). Para determinar si SPOPP-3 (1) y SPOPP-5 (2) tienen efectos diferentes en diferentes tipos de células cancerosas, los evaluamos en 15 líneas celulares de cáncer humano adicionales que comprenden otros 8 tipos diferentes de cánceres humanos. Se usó doxorrubicina como control positivo en las líneas celulares y el resumen se muestra en la Tabla 1. SPOPP-3 (1) sigue siendo inhibitorio con valores de IC50 que van desde 0,63 ± 0,17 µM en la línea de células linfoblastoides T humanas CEM hasta 13,0 ± 1,96 µM en línea celular de hepatoma humano HepG2. Nuevamente, SPOPP-5 (2) mostró una actividad insignificante en cuatro líneas celulares de cáncer adicionales (MiaPaca-2, Panc-1, SKOV3 y MDA-MB-231) (Tabla 1). En base a los resultados de que SPOPP-5 (2) no tuvo un efecto significativo contra la viabilidad celular en 7 líneas celulares de cáncer, no se evaluó más en las otras líneas celulares. El efecto antiproliferativo de SPOPP-3 (1) fue mayor frente a líneas celulares de leucemia humana (IC50 de 0,63 a 3,60 µM), líneas celulares de glioblastoma humano (IC50 de 2,95 a 6,30 µM), líneas celulares de cáncer de colon humano (IC50 de 2,44 a 5,42 µM), líneas celulares de cáncer de cuello uterino humano (IC50 de 4,23 µM), líneas celulares de cáncer de ovario humano (IC50 de 6,30 µM) y líneas celulares de cáncer de mama humano (IC50 de 4,00 a 6,17 µM). SPOPP-3 (1) tiene una actividad antiproliferativa ligeramente más débil contra la línea celular de cáncer de hígado humano (IC50 de 13,03 µM), líneas celulares de cáncer de páncreas humano (IC50 de 8,62 a 9,17 µM) y línea celular de cáncer de próstata humano (IC50 de 9,80 µM) ). En general, los resultados mostraron que SPOPP-3 (1) tiene un efecto antiproliferativo relativamente fuerte en un panel de líneas celulares de cáncer humano. Para comprender el mecanismo por el cual SPOPP-3 (1) ejerce su efecto antiproliferativo en las células, se realizaron los siguientes estudios.

SPOPP-3 (1) inhibió la viabilidad de las células de cáncer de colon humano. La viabilidad celular en células de cáncer de colon humano SW480, HT29 y HCT116 se evaluó mediante el ensayo MTT. Las células se trataron con diferentes concentraciones de SPOPP-3 (1) o SPOPP-5 (2) durante 48 h. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos separados. Las barras de error son SEM.

Para determinar el mecanismo por el cual SPOPP-3 (1) disminuye la viabilidad celular, se realizó citometría de flujo para el análisis del ciclo celular. Como se muestra en la Fig. 3, el tratamiento con SPOPP-3 (1) 20 µM provocó la detención del ciclo celular en la fase G2/M (Fig. 3b). No se observó actividad para SPOPP-5 (2). Para investigar más a fondo si SPOPP-3 (1) induce la detención en la fase G2 o M, realizamos un análisis de transferencia Western para detectar fosfohistona H3, un marcador mitótico sensible establecido17. De hecho, el nivel de fosfohistona H3 aumentó claramente en las células SW480 tratadas con SPOPP-3 (1) pero no con SPOPP-5 (2) (Fig. 4), lo que indica que SPOPP-3 (1) detiene las células SW480 en la fase M. del ciclo celular. Para investigar más a fondo los efectos de SPOPP-3 (1) en el ciclo celular, realizamos experimentos de inmunofluorescencia para estudiar la activación de la ciclina B1. La ciclina B1 es uno de los factores clave en el control de la entrada en la mitosis18,19 con su expresión rápidamente aumentada en la fase G2 y alcanzando su punto máximo en la fase G2 tardía o en la fase M temprana20,21. Como se muestra en la Fig. 5, la población de células tetraploides en las células tratadas con SPOPP-3 (1), como indican las células que tienen una señal de DAPI duplicada, aumentó significativamente en comparación con el control de DMSO. Esto confirma los resultados de la citometría de flujo de que SPOPP-3 (1) provocó la detención del ciclo celular en la fase G2/M, en la que las células no lograron dividirse en células hijas. En las células de control, la mayoría de las células tetraploides tenían una tinción de ciclina B1 significativamente mayor en comparación con las células tetraploides tratadas con SPOPP-3 (Fig. 5b). Por lo tanto, nuestros resultados indican que el tratamiento con SPOPP-3 (1) está asociado con una activación defectuosa de la ciclina B1.

SPOPP-3 (1) detuvo el ciclo celular en la fase G2/M en células SW480. (a) Las células SW480 se trataron con DMSO al 2%, SPOPP-3 20 µM (1) o SPOPP-5 20 µM (2) durante 24 h, después de lo cual las células se recolectaron y se sometieron a análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo. (b) Los resultados de (a) y otras dos réplicas biológicas adicionales (n = 3) se combinaron y expresaron como se muestra. Los porcentajes del ciclo celular se calcularon en base al modelo Watson Pragmatic. Se realizó ANOVA de dos vías: *p < 0,0001.

SPOPP-3 (1) indujo fosfohistona H3 en células SW480. (a) Inmunotransferencias que muestran la expresión de fosfohistona H3 y GAPDH tras el tratamiento con DMSO al 2%, SPOPP-3 20 µM (1) o SPOPP-5 20 µM (2) durante 24 h. (b) Los resultados de (A) y otras dos réplicas biológicas (n = 3) se promediaron y expresaron como se muestra. Se utilizó la prueba t: *p < 0,05.

Inducción defectuosa de ciclina B1 en células tratadas con SPOPP-3 como se muestra mediante experimentos de inmunofluorescencia. Las células SW480 se trataron con SPOPP-3 40 µM o DMSO al 2 % durante 24 h antes de la fijación y la inmunotinción con anticuerpo contra ciclina B1 y DAPI. (a) Imagen representativa de células tratadas con SPOPP-3 (imágenes inferiores) que muestra una gran población de células tetraploides (indicadas por flechas) sin tinción con ciclina B1. Por el contrario, las células tratadas con DMSO tienen una población relativamente pequeña de células tetraploides, todas las cuales expresan ciclina B1. ( b ) Las células tetraploides (con señal DAPI duplicada) (izquierda) y el porcentaje de células tetraploides positivas para ciclina B1 (derecha) se cuantificaron en cada grupo y se presentaron como promedio ± SD. Se utilizó ANOVA de una vía: *p < 0,05. Barra de escala 20 mm.

Para determinar el posible efecto de SPOPP-3 (1) sobre la muerte celular que condujo a la disminución observada en la viabilidad celular, utilizamos citometría de flujo para analizar la apoptosis y la necrosis. Las tinciones comúnmente utilizadas para detectar necrosis y apoptosis son 7-AAD y Anexina V-PE, respectivamente. Después del tratamiento con SPOPP-3 (1), SPOPP-5 (2) o DMSO al 2 % durante 24 h, las células se tiñeron dos veces con 7-AAD y anexina V-PE. Como se muestra en la Fig. 6a, las células tratadas con SPOPP-3 (1) cambiaron a un estado más necrótico (Q1; 32,64 %) en comparación con las células tratadas con DMSO (Q1; 0,5 %), y esto es estadísticamente significativo (Fig. 6b). SPOPP-3 (1) también indujo significativamente la apoptosis (Q2 + Q4) en células SW480 (Fig. 6). Por otro lado, SPOPP-5 (2) no tuvo un efecto significativo sobre la apoptosis o la necrosis en comparación con el control.

SPOPP-3 (1) indujo apoptosis y necrosis en células SW480. (a) Las células SW480 se trataron con DMSO al 2%, SPOPP-3 20 µM (1) o SPOPP-5 20 µM (2) durante 24 h, después de lo cual los lisados celulares se aislaron y se sometieron a análisis de muerte celular mediante citometría de flujo. (b) Los resultados de (a) y otras dos réplicas biológicas adicionales (n = 3) se combinaron y expresaron como se muestra. Se utilizó ANOVA de dos vías: *p < 0,005, **p < 0,0001.

Se llevaron a cabo estudios de inmunofluorescencia para investigar la función potencial de SPOPP-3 (1) como toxina de microtúbulos. Se usaron como controles positivos dos fármacos, vinblastina y colchicina, que se sabe que alteran los microtúbulos. La vinblastina, que pertenece a la familia de los alcaloides de la vinca, se une a la tubulina en un sitio específico e inhibe la formación del huso mitótico, lo que provoca la interrupción del ciclo celular22,23. Cuando se usa en altas concentraciones, se sabe que la vinblastina provoca la formación de paracristales debido a los agregados de tubulina muy compactos24. De hecho, cuando las células SW480 se trataron con vinblastina 50 nM, se observaron paracristales (Fig. 7). La colchicina, por otro lado, interrumpió los microtúbulos y provocó una tinción difusa de α-tubulina en todas las células (Fig. 7). Por el contrario, se pudieron observar husos mitóticos en células tratadas con SPOPP-3 (1). Sin embargo, las posiciones de los husos mitóticos parecían estar interrumpidas en comparación con las células de control tratadas con DMSO (Fig. 7). El desplazamiento de los husos mitóticos también se asoció con la falta de alineación cromosómica en el ecuador de la célula (Fig. 7). En resumen, estos resultados sugieren que aunque SPOPP-3 (1) no interrumpe la formación de microtúbulos, el posicionamiento del huso mitótico parece verse afectado.

SPOPP-3 (1) no provoca la alteración de los microtúbulos. Las células SW480 se trataron con vinblastina 50 nM, colchicina 1 µM o SPOPP-3 40 µM (1) durante 24 h antes de la fijación y la inmunotinción con anticuerpo α-tubulina y DAPI. Los husos mitóticos se observaron claramente en las células tratadas con SPOPP-3 (1), mientras que la colchicina y la vinblastina indujeron la alteración de los microtúbulos a través de diferentes mecanismos. Se puede observar tinción difusa de α-tubulina en el citoplasma y formación de paracristales (flechas) con el tratamiento con colchicina y vinblastina respectivamente. Barra de escala 5 mm.

Con base en los hallazgos de que SPOPP-3 (1) provoca la detención de G2/M asociada con la regulación negativa de la ciclina B1 y el desplazamiento del huso mitótico, es posible que la actividad de SPOPP-3 (1) se produzca a través del daño en el ADN19,25. Para investigar esta posibilidad, utilizamos el método basado en qPCR (LORD-Q) para detectar lesiones en el ADN26. Dado que este método puede detectar daños en el ADN independientemente del tipo de lesión en el ADN, pensamos que este es el método más apropiado. Como se muestra en la Fig. 8, aunque los datos no alcanzaron significación estadística debido a la gran variación en los datos, el efecto de SPOPP-3 (1) sobre el daño en el ADN puede detectarse tan pronto como 1 hora después del tratamiento. Sin embargo, dicho efecto se redujo mucho después de 20 h de tratamiento (Fig. 8).

SPOPP-3 (1) indujo daño en el ADN. Cuantificación de lesiones de ADN usando LORD-Q en células SW480 tratadas con 40 µM SPOPP-3 (1) durante los períodos de tiempo indicados. Los amplicones cortos y largos amplificados a partir del gen mtDNA se utilizaron en la cuantificación de lesiones en el ADN mitocondrial. Los datos presentados se promedian a partir de tres repeticiones biológicas ± SEM (n = 3).

En este estudio, informamos la síntesis de SPOPP-3 (1) y mostramos por primera vez que tiene una fuerte actividad antiproliferativa contra 18 líneas celulares de cáncer humano (Tabla 1). Para nuestra sorpresa, usando el procedimiento de síntesis previamente informado15,16, también obtuvimos el isómero estructural SPOPP-5 (2), un compuesto novedoso. Creemos que SPOPP-5 (2) se formó en nuestras manos porque usamos 35 °C y 3 h para la síntesis mientras que Haddad et al.15 sometieron a reflujo su reacción de síntesis a 65 °C durante 2 h. Se sabe que una temperatura de síntesis más baja durante las reacciones de cicloadición favorece un producto más cinéticamente controlado16. En contraste con SPOPP-3 (1), SPOPP-5 (2) prácticamente no tenía actividad antiproliferativa (Tabla 1). Especulamos que la configuración de los dos grupos carbonilo en SPOPP-3 (1), específicamente en ausencia de componentes químicos adicionales entre ellos, puede contribuir a su actividad antiproliferativa (Fig. 1). Sería necesario realizar futuros estudios de relación estructura-actividad para probar esta hipótesis. El efecto diferencial de SPOPP-3 en las diferentes líneas celulares de cáncer podría estar relacionado con la tasa de crecimiento de las líneas celulares. Por ejemplo, SPOPP-3 tiene un efecto antiproliferativo más fuerte en las líneas celulares de leucemia humana de crecimiento más rápido (K562, KG1a, CEM) y líneas celulares de glioblastoma (U251, U87), pero tiene un efecto más débil en la línea celular de cáncer de hígado HepG2 de crecimiento más lento, Línea celular de cáncer de próstata DU145 y líneas celulares de cáncer de páncreas (MiaPaca2, Panc1) (Tabla 1). Curiosamente, esto no es cierto para el control positivo de doxorrubicina que mostró un fuerte efecto antiproliferativo tanto en células de crecimiento más rápido (U251, U87) como en células de crecimiento más lento (DU145, SKOV3). Tales observaciones sugirieron que SPOPP-3 y doxorrubicina ejercían su efecto antiproliferativo a través de diferentes mecanismos.

La actividad antiproliferativa de SPOPP-3 (1) se asoció con su capacidad para inducir apoptosis y necrosis (Fig. 6), así como con su capacidad para provocar la detención del ciclo celular en la fase G2/M (Fig. 3). Usando histona H3 fosforilada como marcador de fase M, se demostró que al menos algunas células estaban detenidas en fase M (Fig. 4). Nuestros resultados también mostraron que la expresión de ciclina B1 se redujo drásticamente con el tratamiento con SPOPP-3 (1) (Fig. 5). Aunque un aumento en la expresión de ciclina B1 en la fase G2 tardía y su translocación al núcleo es importante para el inicio de la mitosis, su agotamiento mediante la eliminación de siRNA no hace que las células se detengan solo en la fase G2, ya que esto puede explicarse por la función redundante. de ciclina B218,27. También demostramos mediante microscopía que, si bien los microtúbulos parecen no verse afectados por el tratamiento con SPOPP-3 (1), se observaron defectos en la fase M, incluido el posicionamiento del huso mitótico y la alineación cromosómica condensada (Fig. 7). Esto puede deberse a la disminución de los niveles de ciclina B1, ya que se sabe que la ciclina B1 normalmente se recluta en centrosomas y cinetocoros28,29. Investigamos más a fondo si SPOPP-3 (1) causa daño en el ADN, ya que se ha documentado que los niveles de ciclina B1 se reducen como resultado del daño en el ADN30,31. De hecho, nuestros resultados sugieren que, de manera similar a la bleomicina26, nuestros resultados muestran que SPOPP-3 (1) causa daño en el ADN en una etapa temprana que fue detectable 1 h pero no 20 h después del tratamiento (Fig. 8). Esto es similar al efecto de la bleomicina26 y probablemente sea el resultado de la rápida respuesta de reparación del daño en el ADN 32. Como consecuencia, un evento tan temprano de daño en el ADN podría conducir a la reducción de la ciclina B1, la detención del ciclo celular, la apoptosis y la necrosis, que son procesos celulares. que ocurren mucho más tarde.

Las propiedades antiproliferativas de SPOPP-3 (1) tienen implicaciones importantes en la terapia del cáncer. La letalidad sintética es un enfoque novedoso en el tratamiento del cáncer4,5. Dado que SPOPP-3 (1) es un potente inductor de la detención de G2/M, tiene el potencial de usarse en combinación con inhibidores de puntos de control de G2/M para desencadenar una catástrofe mitótica que actualmente se considera una estrategia de tratamiento favorable para mejorar la muerte celular ya sea vía apoptosis, necrosis o autofagia1,2,3,4,5. En particular, en la mayoría de los casos de melanoma en los que la transición G1/S mediada por la vía ciclina-CDK4 es defectuosa y tiene una mayor dependencia del punto de control G2/M para inducir la detención del ciclo celular cuando se expone al daño del ADN, SPOPP-3 (1) puede tener una ventaja añadida en combinación con inhibidores de G2/M4. En segundo lugar, encontramos que SPOPP-3 (1) es un inductor de necrosis. Varias líneas de investigación han brindado evidencia para respaldar el papel de la necrosis en la mejora de la inmunoterapia contra el cáncer y como una posible estrategia para superar la resistencia de las células cancerosas a la apoptosis33,34. Para ello, será importante evaluar si SPOPP-3 (1) tiene tal capacidad para inducir procesos proinflamatorios mediante la liberación de patrones moleculares asociados al daño, como la proteína del grupo 1 de alta movilidad (HMGB1), marcador de necrosis . La liberación de dichos factores en la matriz extracelular puede provocar la activación de los leucocitos CD8+ y promover la inmunidad antitumoral34.

También es importante descifrar más el mecanismo por el cual SPOPP-3 (1) detiene las células en la fase G2/M. Por ejemplo, se ha demostrado que los derivados de piperazina generan especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de las células35. Por lo tanto, sería de interés investigar si SPOPP-3 (1) puede generar ROS que provoquen daño oxidativo en el ADN y la subsiguiente detención en la fase G2/M. En cuanto a la necrosis, uno de los modos de muerte celular detectados en las células tratadas con SPOPP-3 (1), se ha vuelto cada vez más claro que la necrosis puede no ser simplemente un proceso celular descontrolado, sino una vía regulada comúnmente conocida como necroptosis36. También se ha informado que la necroptosis aumenta la metástasis del cáncer en ciertas líneas celulares37. La dualidad de que la necroptosis es anti- y pro-tumoral aún requiere investigación para determinar en qué contexto es beneficiosa la necroptosis. Dado que hemos encontrado una actividad antiproliferativa respetable de SPOPP-3 (1) contra un gran panel de líneas celulares de cáncer, sería fundamental estudiar más a fondo el modo de muerte celular en diferentes líneas celulares.

En conclusión, describimos la síntesis y la caracterización bioquímica de un derivado específico de la dispiropiperazina llamado SPOPP-3 (1) con fuerte actividad antiproliferativa contra un amplio panel de líneas celulares de cáncer humano. SPOPP-3 (1) es capaz de inducir daño en el ADN, apoptosis, necrosis, detiene el ciclo celular en la fase G2/M e interrumpe el posicionamiento normal del huso mitótico. Este estudio ha sentado las bases para un mayor desarrollo de SPOPP-3 (1) para su posible uso como herramienta química para perturbar y comprender los procesos celulares, así como un posible compuesto anticancerígeno. Para este último, SPOPP-3 (1) debe explorarse en un enfoque de letalidad sintética y como un compuesto anticancerígeno inductor de necrosis.

Adoptamos el método descrito anteriormente para sintetizar espiro[2′,3]-bis(acenafteno-1′-ona)perhidrodipirrolo-[1,2-a:1,2-d]-pirazina (SPOPP-3, 1)15 ,dieciséis. Una mezcla de acenaftenequinona (1,822 g, 10 mmol) y l-prolina (1,151 g, 10 mmol; Sigma-Aldrich) se disolvió en metanol (200 ml) y se calentó a 35 °C durante 3 h. La reacción se controló mediante cromatografía en capa fina (TLC) usando acetato de etilo:hexano (1:2; v/v) y las manchas se visualizaron usando luz ultravioleta (254 nm). Típicamente, se formó un precipitado anaranjado durante la primera hora que cambió a un color marrón anaranjado después de una hora adicional ya un color marrón oscuro después de completarse la reacción. El disolvente se eliminó a presión reducida dejando un polvo marrón oscuro (1,722 g). El producto bruto, que contenía tanto SPOPP-3 (1) como SPOPP-5 (2), se mezcló con 2 g de sílice normal en 200 ml de metanol. El disolvente se eliminó a presión reducida y la mezcla de sílice se cargó en seco en una columna. Se utilizó la purificación por cromatografía ultrarrápida, utilizando sílice en fase normal (50 g) y una mezcla 9:1 de hexanos y acetato de etilo a un caudal de 12 ml/min, para aislar una mezcla de SPOPP-3 (1) y SPOPP -5 (2). Se llevó a cabo una purificación posterior con tres ciclos de cromatografía ultrarrápida empleando un total de 686 mg de producto bruto. Se secó a presión reducida una banda de color naranja que eluía a 530-830 ml correspondiente a Rf = 0,14 con 9:1 (hexanos:acetato de etilo) para producir 280 mg de SPOPP-3 semipurificado (1). Posteriormente, SPOPP-3 (1) se purificó para pruebas biológicas mediante HPLC utilizando una columna Phenomenex Luna 5u Phenyl-Hexyl de 4,60 mm × 250 mm. Se utilizó como condiciones de eluyente un gradiente de 80 a 92% de acetonitrilo durante 6 min a un caudal de 2 ml/min. Para el SPOPP-3 semipurificado (1), se inyectó un total de 12,5 mg en la HPLC y se obtuvieron 5 mg (16 %) de SPOPP-3 (1) purificado (a una retención de 4,08 min). Una banda de color amarillo que eluyó a 320-405 ml correspondiente a Rf = 0,24 (9:1 hexanos:acetato de etilo) produjo 120 mg de SPOPP-5 purificado (2). SPOPP-5 (2) se purificó utilizando las mismas condiciones de HPLC que SPOPP-3 (1). Se inyectaron ciento veinte mg de SPOPP-5 (2) semipurificado en HPLC y se obtuvieron 21 mg (3%) de SPOPP-5 (2) purificado (a una retención de 6,02 min). Se utilizaron análisis HPLC-MS y NMR para confirmar la identidad de SPOPP-3 (1) y SPOPP-5 (2). Los espectros de RMN 1D y 2D se registraron en un espectrómetro de RMN Agilent/Varian Inova de 400 MHz con un tubo de RMN Kimble de 5 mm (Rockwood, TN, EE. UU.) en la Universidad de Alberta o en un RMN Bruker de 600 MHz con una sonda criogénica en la Universidad de Columbia Británica. Todos los análisis de HPLC se realizaron en Agilent 1260 Infinity Systems con detector UV, y la espectrometría de masas se realizó con Agilent 6120 Single Quad MS.

Se recristalizaron cristales individuales naranjas irregulares de SPOPP-5 (2) (50 mg) en acetonitrilo (10 ml) mediante evaporación lenta. Los cristales se obtuvieron el día 7. Se seleccionó un cristal adecuado con dimensiones de 0,22 × 0,20 × 0,11 mm3 y se montó en un difractómetro de detector de área Bruker APEX II. El cristal se mantuvo a una T constante = 90(2) K durante la recopilación de datos. La estructura se resolvió con el programa de solución ShelXT38 utilizando métodos duales y Olex239 como interfaz gráfica. El modelo se refinó con XL38 utilizando la minimización de mínimos cuadrados de matriz completa en F2.

Todas las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection excepto HT29 (adenocarcinoma de colon) que se obtuvo del Dr. Ranjana Bird en la UNBC. Todas las células se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (Lonza), excepto las siguientes: MiaPaca-2 y Panc-1 se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (Lonza), mientras que K562, KG1a y CEM se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Lonza). Todos los medios se suplementaron con suero bovino fetal al 10% (Life Technologies Inc.) y antibióticos.

El ensayo de MTT citotóxico se utilizó para evaluar la viabilidad celular como se describió previamente40. Brevemente, las células se colocaron en placas a una densidad de 1,5 × 103 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Después de 24 h, las células se trataron con SPOPP-3 (1) o SPOPP-5 (2) durante 48 h con un rango de concentración de 0,16 a 100 µM. Las células se trataron con el control positivo de doxorrubicina de 0,003 a 0,8 µM. Todos los datos de absorbancia se expresaron en relación con el control, 0,1 % de DMSO, tomado como 100 % de viabilidad celular.

Las células SW480 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 3,0 x 105 células por pocillo y luego se trataron al día siguiente con SPOPP-3 20 µM (1), SPOPP-5 20 µM (2) o DMSO al 2% para 24 horas Los lisados celulares se prepararon como se describió previamente41. Para el análisis de inmunotransferencia, las muestras de proteína se resolvieron en SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. El anticuerpo fosfo H3 (Ser10) (D2C8, 1:1000, Cell Signaling) se usó con una incubación durante la noche a 4 °C. También se utilizó anti-GAPDH (G8795, clon GAPDH-71.1, 1:20.000, Sigma). IgM-HRP anti-ratón (sc-2064, 1:4000, Santa Cruz Biotechnology), IgG-HRP anti-ratón (W402B, 1:4000, Promega) y IgG-HRP anti-conejo (W401B, 1:4000, Promega ) se utilizaron como anticuerpos secundarios. Todas las transferencias se visualizaron con el sistema FluorChem Q (ProteinSimple). El análisis de densitometría se realizó utilizando el software AlphaView Q (ProteinSimple).

Las células se colocaron en placas a razón de 2,5 × 105 células/pocillo en placas de 6 pocillos y se trataron con los compuestos descritos anteriormente. Las células se tripsinizaron seguido de centrifugación y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato. Las células vivas se tiñeron con PE anexina V y 7-AAD de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit de detección de apoptosis I (BD Pharmingen) y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un clasificador de células BD FACSMelody (BD Biosciences) y el software BD FACSChorus (V 1.0). Para el análisis del ciclo celular, se usó el kit de reactivos BD Cycletest plus DNA para teñir el ADN y los datos se analizaron usando el software FlowJo.

Las células SW480 se sembraron en cámaras de vidrio de cubierta de 4 pocillos a una densidad de 15 × 104 células por pocillo con 0,5 ml de EMEM. Las células se trataron con los fármacos indicados durante 24 h antes de la fijación utilizando metanol al 100 % (-20 °C) durante 10 min. Posteriormente, las células se bloquearon usando PBS con BSA al 2 % y Triton-x-100 al 0,1 % y luego se tiñeron con anticuerpo α-tubulina (1:100; Ab4074; Abcam) o anticuerpo ciclina B1 (D5C10, 1:200, señalización celular). ). Se usaron anti-ratón-AF594 y anti-conejo-AF 594 (1:200; Molecular Probes) como anticuerpos secundarios, respectivamente. Todos los anticuerpos utilizados se diluyeron en PBS con BSA al 0,5 % y Triton-x-100 al 0,1 %. Todos los pasos de bloqueo e incubación de anticuerpos se realizaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de cada paso de incubación de anticuerpos, las células se lavaron 3 veces (10 min cada una) con tampón de lavado que contenía Triton-x-100 al 0,1 % en PBS. Para la inmunofluorescencia de ciclina B1, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente. Para teñir el ADN, las células se incubaron con diclorhidrato de DAPI (300 nM diluido en PBS) durante 5 minutos después de la inmunotinción con el anticuerpo secundario. Todas las imágenes de fluorescencia se tomaron con un microscopio invertido Zeiss Axio Observer Z1 con platina motorizada, cámara mono Zeiss Axiocam 503, fuente de luz LED multicolor Colibri 2, Plan-Apochromat 20×/0,8 M27 o Plan-Apochromat 63×/1,4 Oil DIC M27 como objetivos. Para la cuantificación de células tetraploides, la señal DAPI en cada celda se cuantificó en cada imagen utilizando la función de región de interés en el software Zen. Las células tetraploides se distinguieron con una señal DAPI doble que las células restantes en la misma imagen. Se cuantificaron tres imágenes (cada una con al menos 36 células) de cada grupo. A continuación, se determinó en cada imagen la población de células tetraploides que eran positivas para ciclina B1 y se presentó como un promedio para cada grupo. Se incluyeron sulfato de vinblastina y colchicina (ambos adquiridos de Sigma) como controles positivos para toxinas de microtúbulos.

Para evaluar si el tratamiento con SPOPP-3 causa daño en el ADN, se utilizó un método basado en PCR en tiempo real a largo plazo (LORD-Q) con modificaciones26. Las células SW480 (2,5 × 106) se trataron en placas de 6 pocillos con DMSO (control) o SPOPP-3 40 μM durante los períodos de tiempo indicados antes de recolectarlas para el aislamiento total del ADN mediante el kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). El método LORD-Q se llevó a cabo utilizando los conjuntos de cebadores establecidos para los amplicones largos y cortos para el gen mtDNA26. Las eficiencias de la PCR se calcularon utilizando 37,5, 18,75, 9,375 y 4,688 ng de ADN como plantilla por reacción de PCR. La reacción de rtPCR (volumen total de 15 μL) consistió en 0,05 × colorante ResoLight, 1 × KAPA2G Fast Hot Start ReadyMix, 500 nM de cebador directo e inverso, y las cantidades antes mencionadas de ADN aislado como plantilla. Para la amplificación de amplicones cortos como referencia, se utilizó Quantabio PerfeCTa® SYBR® Green FastMix®. El análisis de PCR en tiempo real se llevó a cabo con un sistema Bio-Rad CFX96 y el análisis de datos se realizó con el software CFX Maestro. El número de lesiones por 10 kb se calculó con base en la ecuación previamente establecida26,42. Los datos presentados se promedian a partir de 3 réplicas biológicas ± SEM

Los ensayos de MTT citotóxico se realizaron por triplicado (3 pocillos/tratamiento) y la lectura de absorbancia del control respectivo se tomó como viabilidad celular del 100%. Para el análisis de inmunotransferencia, la densitometría de las bandas de fosfohistona H3 se normalizó a sus respectivas bandas de GAPDH y luego se expresó en relación con el control de DMSO (tomado como 1,0). Se realizó ANOVA de una o dos vías como se indica. Los datos se expresan como media ± SD y se analizaron utilizando GraphPad Prism versión 8.0.2 (La Jolla, CA) o la prueba t. Se utilizó la prueba de Holm-Sidak para el análisis post-hoc. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

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Este proyecto fue apoyado por fondos de NSERC Discovery Grant (227158) para CHL, la Fundación Canadiense para la Innovación (34711) para CHL y el Fondo de Desarrollo del Conocimiento de BC (103970) para CHL. VL, MZ y JL fueron apoyados por UNBC Research Project Awards.

Departamento de Química y Bioquímica, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad del Norte de Columbia Británica, Prince George, BC, V2N 4Z9, Canadá

Victor P. Liu, Wai-Ming Li, Jack Lofroth, Mehreen Zeb y Chow H. Lee

Departamento de Química, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, BC, V6T 1Z1, Canadá

Brian O.Patrick

Departamento de Ciencias Físicas, Universidad MacEwan, 10700-104 Avenue, Edmonton, AB, T5J 4S2, Canadá

Tina M. Bott

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VPL, WML y CHL conceptualizado y diseñado el estudio. VPL realizó la síntesis y los experimentos para preparar las Figs. 1, 3, 4, 6 y las Figs. S1–S11. WML realizó los experimentos y preparó las Figs. 5, 7 y 8. BOP realizó los experimentos de cristalografía de rayos X y preparó la Fig. S11. VL, JL y CHL realizaron los ensayos MTT y prepararon la Fig. 2 y la Tabla 1. MZ realizó algunos de los experimentos de citometría de flujo y preparó la Fig. 6. CHL, WML y TMB se encargaron de la supervisión. CHL escribió el primer borrador del manuscrito y manejó las revisiones del manuscrito. CHL proporcionó financiación e instalaciones de investigación. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Chow H. Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Liu, VP, Li, WM., Lofroth, J. et al. Un derivado específico de la dispiropiperazina que detiene el ciclo celular, induce la apoptosis, la necrosis y el daño del ADN. Informe científico 13, 8674 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35927-6

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Recibido: 16 de marzo de 2023

Aceptado: 25 de mayo de 2023

Publicado: 29 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35927-6

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