Base estructural de la percepción del olor a base de aminas por parte de un receptor olfativo de mamíferos | Shijiazhuang Agile Peak Ventures Co., Ltd.

Nature volumen 618, páginas 193–200 (2023)Citar este artículo

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Los olores se detectan como olor en el epitelio nasal de los mamíferos por dos familias de receptores acoplados a proteína G, los receptores de olores y los receptores asociados a trazas de aminas1,2 (TAAR). Los TAAR surgieron después de la divergencia de peces con mandíbula y sin mandíbula, y comprenden una gran familia monofilética de receptores que reconocen olores de aminas volátiles para provocar comportamientos innatos tanto intraespecíficos como interespecíficos, como la atracción y la aversión3,4,5. Aquí informamos estructuras de microscopía electrónica criogénica de ratón TAAR9 (mTAAR9) y mTAAR9-Gs o mTAAR9-Golf trímeros en complejo con β-feniletilamina, N, N-dimetilciclohexilamina o espermidina. Las estructuras de mTAAR9 contienen un bolsillo de unión a ligando profundo y estrecho decorado con un motivo D3.32W6.48Y7.43 conservado, que es esencial para el reconocimiento de odorantes de amina. En la estructura de mTAAR9, se requiere un enlace disulfuro único que conecta el extremo N terminal con ECL2 para la activación del receptor inducida por agonistas. Identificamos motivos estructurales clave de los miembros de la familia TAAR para detectar monoaminas y poliaminas y la secuencia compartida de diferentes miembros TAAR que son responsables del reconocimiento del mismo olor químico. Aclaramos la base molecular del acoplamiento de mTAAR9 a Gs y Golf mediante caracterización estructural y análisis mutacional. En conjunto, nuestros resultados proporcionan una base estructural para la detección de olores, la activación del receptor y el acoplamiento Golf de un receptor olfativo de amina.

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Todos los datos producidos o analizados en este estudio se incluyen en el texto principal o en los materiales complementarios. Los mapas de densidad crio-EM y las coordenadas atómicas se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica con los códigos de acceso EMD-35762 (complejo SPE–mTAAR9–Gs), EMD-35763 (complejo PEA–mTAAR9–Gs), EMD-35705 (DMCHA –complejo mTAAR9–Gs), EMD-35764 (complejo CAD–mTAAR9–Gs), EMD-35761 (complejo PEA–mTAAR9–Golf), EMD-35765 (refinamiento local para el complejo SPE–mTAAR9) y EMD-35771 (complejo local refinamiento para PEA–mTAAR9 en el complejo PEA–mTAAR9–Gs), y Protein Data Bank bajo los códigos de acceso 8IW4 (complejo SPE–mTAAR9–Gs), 8IW7 (complejo PEA–mTAAR9–Gs), 8ITF (complejo DMCHA–mTAAR9–Gs ), 8IW9 (complejo CAD–mTAAR9–Gs), 8IW1 (complejo PEA–mTAAR9–Golf), 8IWE (refinamiento local para el complejo SPE–mTAAR9) y 8IWM (refinamiento local para PEA–mTAAR9 en el complejo PEA–mTAAR9–Gs ). Todos los demás datos están disponibles previa solicitud a los autores correspondientes.

Liberles, SD & Buck, LB Una segunda clase de receptores quimiosensoriales en el epitelio olfativo. Naturaleza 442, 645–650 (2006).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Buck, L. & Axel, R. Una nueva familia multigénica puede codificar receptores de olores: una base molecular para el reconocimiento de olores. Celda 65, 175–187 (1991).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Dewan, A., Pacifico, R., Zhan, R., Rinberg, D. & Bozza, T. Codificación no redundante de olores aversivos en la vía olfativa principal. Naturaleza 497, 486–489 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Q. et al. Evolución sincrónica de una ruta de biosíntesis de olores y respuesta conductual. actual Biol. 23, 11–20 (2013).

Artículo PubMed Google Académico

Saraiva, LR et al. Efectos combinatorios de los odorantes en el comportamiento del ratón. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 113, E3300–3306 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Q. & Liberles, SD Aversión y atracción por el olfato. actual Biol. 25, R120–R129 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liberles, SD Feromonas de mamíferos. Año. Rdo. Fisiol. 76, 151–175 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Greer, PL et al. Una familia de quimiosensores que no son GPCR define una lógica alternativa para el olfato de los mamíferos. Celda 165, 1734–1748 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Butterwick, JA et al. Estructura crio-EM del receptor olfativo de insectos Orco. Naturaleza 560, 447–452 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Del Marmol, J., Yedlin, MA & Ruta, V. La base estructural del reconocimiento de olores en los receptores olfativos de insectos. Naturaleza 597, 126–131 (2021).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guo, L. et al. Evolución de los receptores de aminas biogénicas expresados en el cerebro en receptores asociados a aminas traza olfativas. mol. Biol. Evol. 39, msac006 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gainetdinov, RR, Hoener, MC & Berry, MD Trazas de aminas y sus receptores. Farmacol. Rev. 70, 549–620 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Xu, Z. & Li, Q. Agonistas de TAAR. Mol celular. Neurobiol. 40, 257–272 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ferrero, DM et al. Detección y evitación de un olor carnívoro por parte de la presa. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 108, 11235–11240 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jia, L. et al. Los receptores asociados a aminas trazas olfativas convergentes detectan poliaminas biogénicas con distintos motivos a través de un sitio de unión conservado. J. Biol. química 297, 101268 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Q. et al. El reconocimiento de aminas no clásicas evolucionó en un gran clado de receptores olfativos. eLife 4, e10441 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hussain, A., Saraiva, LR & Korsching, SI Selección darwiniana positiva y el nacimiento de un clado de receptores olfativos en teleósteos. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 106, 4313–4318 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ghislain, J. & Poitout, V. Orientación de los GPCR de lípidos para tratar la diabetes mellitus tipo 2: avances y desafíos. Nat. Rev. Endocrinol. 17, 162–175 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wingler, LM et al. Los análogos de angiotensina con sesgo divergente estabilizan distintas conformaciones de receptores. Celda 176, 468–478.e411 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmid, CL et al. El factor de sesgo y la ventana terapéutica se correlacionan para predecir analgésicos opioides más seguros. Celda 171, 1165–1175 e1113 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cao, C. et al. Estructura, función y farmacología de los GPCR de picor humano. Naturaleza 600, 170–175 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, F. et al. Estructura, función y farmacología de los complejos receptores del picor humanos. Naturaleza 600, 164–169 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Yang, F. et al. Base estructural de la activación de GPBAR y reconocimiento de ácidos biliares. Naturaleza 587, 499–504 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Ping, YQ et al. Estructuras del complejo GPR97-Go del receptor de adhesión unido a glucocorticoides. Naturaleza 589, 620–626 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Latorraca, NR, Venkatakrishnan, AJ & Dror, RO Dinámica de GPCR: estructuras en movimiento. química Rev. 117, 139–155 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wang, S. et al. Estructura del receptor de dopamina D2 unido al fármaco antipsicótico atípico risperidona. Naturaleza 555, 269–273 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiao, P. et al. Reconocimiento de ligandos y regulación alostérica de complejos de señalización DRD1-Gs. Celda 184, 943–956.e918 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Waterhouse, A. et al. SWISS-MODEL: modelado por homología de estructuras y complejos proteicos. Ácidos Nucleicos Res. 46, W296–W303 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Malnic, B., Hirono, J., Sato, T. & Buck, LB Códigos de receptores combinatorios para odorantes. Celda 96, 713–723.

Artículo CAS PubMed Google Académico

Duan, J. et al. Activación del receptor de tirotropina mediada por hormonas y anticuerpos. Naturaleza 609, 854–859 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Duan, J. et al. Estructuras de complejos de señalización de receptores de hormonas glicoproteicas de longitud completa. Naturaleza 598, 688–692 (2021).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Duan, J. et al. Estructura crio-EM de un complejo de proteína receptor-G VIP1 activado revelado por una estrategia de anclaje NanoBiT. Nat. común 11, 4121 (2020).

Zhao, LH et al. Estructura y dinámica del receptor-1 de la hormona paratiroidea humana activa. Ciencia 364, 148–153 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carpenter, B., Nehme, R., Warne, T., Leslie, AG y Tate, CG Estructura del receptor de adenosina A2A unido a una proteína G diseñada. Naturaleza 536, 104–107 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koehl, A. et al. Estructura del complejo receptor micro-opioide-proteína Gi. Naturaleza 558, 547–552 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: corrección anisotrópica del movimiento inducido por haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, K. Gctf: determinación y corrección de CTF en tiempo real. J. Estructura. Biol. 193, 1–12 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J. et al. Nuevas herramientas para la determinación automatizada de estructuras crio-EM de alta resolución en RELION-3. eLife 7, e42166 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Ping, YQ et al. Base estructural para la activación del péptido anclado de los GPCR de adhesión. Naturaleza 604, 763–770 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Cómputo. química 25, 1605–1612 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: herramientas de construcción de modelos para gráficos moleculares. Acta Crystallogr. D 60, 2126–2132 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Adams, PD et al. PHENIX: un sistema integral basado en Python para la solución de estructuras macromoleculares. Acta Crystallogr. D 66, 213–221 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jumper, J. et al. Predicción de estructura de proteínas de alta precisión con AlphaFold. Naturaleza 596, 583–589 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Halgren, TA Identificación y caracterización de los sitios de unión y evaluación de la farmacabilidad. J. Chem. información Modelo. 49, 377–389 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shelley, JC et al. Epik: un programa de software para la predicción de pKa y la generación de estados de protonación para moléculas similares a fármacos. J. Cómputo. Mol asistido. Des. 21, 681–691 (2007).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Más duro, E. et al. OPLS3: un campo de fuerza que proporciona una amplia cobertura de proteínas y moléculas pequeñas similares a fármacos. J. Chem. Cálculo de la teoría. 12, 281–296 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Friesner, RA et al. Deslizamiento de precisión adicional: acoplamiento y puntuación que incorporan un modelo de recinto hidrofóbico para complejos proteína-ligando. J.Med. química 49, 6177–6196 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Vanommeslaeghe, K. & MacKerell, AD Jr. Automatización del campo de fuerza general CHARMM (CGenFF) I: percepción de enlaces y tipificación de átomos. J. Chem. información Modelo. 52, 3144–3154 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jo, S., Kim, T., Iyer, VG & Im, W. CHARMM-GUI: una interfaz gráfica de usuario basada en web para CHARMM. J. Cómputo. química 29, 1859–1865 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Huang, J. & MacKerell, AD Jr. CHARMM36 campo de fuerza de proteína aditiva de todos los átomos: validación basada en comparación con datos de RMN. J. Cómputo. química 34, 2135–2145 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumari, R., Kumar, R., Open Source Drug Discovery Consortium & Lynn, A. g_mmpbsa: una herramienta GROMACS para cálculos de MM-PBSA de alto rendimiento. J. Chem. información Modelo. 54, 1951-1962 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Srinivasan, J., Cheatham, TE, Cieplak, P., Kollman, PA & Case, DA Estudios de solventes continuos de la estabilidad de las hélices de ADN, ARN y fosforamidato-ADN. Mermelada. química Soc. 120, 9401-9409 (1998).

Artículo CAS Google Académico

Lu, S. et al. Mapeo de enlaces disulfuro nativos a escala de proteoma. Nat. Métodos 12, 329–331 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chen, ZL y col. Un motor de búsqueda de alta velocidad pLink 2 con evaluación sistemática para la identificación a escala de proteoma de péptidos entrecruzados. Nat. común 10, 3404 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Olsen, RHJ et al. TRUPATH, una plataforma de biosensores de código abierto para interrogar el transduceroma GPCR. Nat. química Biol. 16, 841–849 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheng, J. et al. La detección autónoma del péptido de insulina por parte de un receptor olfatorio acoplado a proteína G modula el metabolismo de la glucosa. Metab. celular 34, 240–255 e210 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Miller, BR 3rd et al. MMPBSA.py: un programa eficiente para cálculos de energía libre en estado final. J. Chem. Cálculo de la teoría. 8, 3314–3321 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

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Este trabajo fue financiado por el Programa Nacional de I+D clave de China (2022YFC2702600 a FY, 2018YFC1003600 a XY y J.-PS, 2019YFA0904200 a J.-PS, 2021ZD0203100 a Q. Li y 2022YFA1104003 a YX), National Science Fund for Distinguished Young Scholar s Subvención (81825022 a J.-PS), Fondo Nacional de Ciencias para Excelentes Jóvenes Académicos (82122070 a FY y 32122038 a QL), Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81773704 a J.-PS y 92057121 a XY), Proyecto de Investigación Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing, China (Z200019 a J.-PS), Programa Principal de Investigación Fundamental de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong, China (ZR2021ZD18 a XY y ZR2020MH132 a S. Liu), el Proyecto de Investigación Básica de la Ciencia y Comisión de Tecnología de la Municipalidad de Shanghái (21JC1404500 a QL), Proyecto de Investigación y Desarrollo Clave de la Provincia de Shandong (2021CXGC011105 a YX) y Programa Shuguang respaldado por la Fundación para el Desarrollo de la Educación de Shanghái y la Comisión de Educación Municipal de Shanghái (21SG16 a QL). Las simulaciones moleculares se realizaron en la plataforma HPC Cloud de la Universidad de Shandong. Agradecemos a Y. Yin y W. Shui por la recopilación de datos. SDL es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Estos autores contribuyeron por igual: Lulu Guo, Jie Cheng, Shuo Lian, Qun Liu, Yan Lu, Yuan Zheng, Kongkai Zhu

Instituto de Investigación Médica Avanzada, Parque de Investigación Traslacional del Lago Meili, Facultad de Medicina de Cheeloo, Universidad de Shandong, Jinan, China

Lulu Guo, Jie Cheng, Kongkai Zhu, Xiang Han, Shangming Liu, Fan Yang y Jin-Peng Sun

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Shandong, Jinan, China

Lulu Guo, Qun Liu, Yan Lu, Chao Zhang, Naikang Rong, Yuming Zhuang, Guoxing Fang, Jingjing Jiang, Tianyao Zhang, Xiang Han, Zili Liu, Fan Yang y Jin-Peng Sun

Teratología Experimental de Laboratorio Clave del Ministerio de Educación y Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Universidad de Shandong, Jinan, China

Jie Cheng y Xiao Yu

Departamento de Fisiología y Fisiopatología, Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Universidad de Pekín, Laboratorio Clave de Ciencias Cardiovasculares Moleculares, Ministerio de Educación, Pekín, China

Jie Cheng, Yuan Zheng y Jin-Peng Sun

Departamento de Cirugía General, Hospital Qilu de la Universidad de Shandong, Jinan, China

Shuo Lian, Minghui Zhang y Yunfei Xu

Instituto Songjiang y Hospital Songjiang, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, China

Yalei kong y qian li

Centro de Ciencias del Cerebro, Centro Médico Infantil de Shanghái, Facultad de Medicina, Universidad Jiao Tong de Shanghái, Shanghái, China

Yalei kong y qian li

Departamento de Anatomía y Fisiología, Ministerio de Educación-Laboratorio Clave de Salud Ambiental Infantil de Shanghai en el Hospital Xinhua, Escuela de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, China

Yalei kong y qian li

Departamento de Otorrinolaringología, Hospital Provincial de Shandong Afiliado a la Primera Universidad Médica de Shandong, Shandong, China

MingXia

Laboratorio clave del Ministerio de Educación para la síntesis de no equilibrio y la modulación de la materia condensada, Escuela de Física, Universidad Xi'an Jiaotong, Xi'an, China

lei zhang

Instituto Médico Howard Hughes, Departamento de Biología Celular, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Esteban D. Liberles

Centro de Investigación de Shanghái para la Ciencia del Cerebro y la Inteligencia Inspirada en el Cerebro, Shanghái, China

qian li

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J.-PS y Q. Li iniciaron el estudio de los receptores olfativos TAAR. J.-PS, YX y FY organizaron el proyecto. J.-PS, XY y FY diseñaron y supervisaron el diseño y la ejecución experimental general. J.-PS, YX, FY, LG y JC participaron en el análisis e interpretación de datos. J.-PS y FY guiaron todo el análisis estructural. Q. Li y SDL proporcionaron plásmidos TAAR originales y modificados, y organizaron experimentos funcionales junto con J.-PS, XY y FYLG y Q. Liu diseñó y ejecutó la detección de receptores para estudios estructurales. YK, LG, Q. Liu y Q. Li generaron la construcción de expresión de células de insectos mTAAR9. LG, Y. Zheng e YX establecieron los protocolos de purificación complejos PEA–mTAAR–Gs–scFv16, SPE–mTAAR–Gs–scFv16 y PEA–mTAAR9–Golf–scFv16 y prepararon muestras para crio-EM. JC, S. Lian e YL generaron construcciones mTAAR9 y mutantes para los ensayos de actividad de proteína G basados en células. JC, S. Lian, XH, S. Liu e YL diseñaron mutantes de interacción de proteína G y bolsillo de unión a ligando. JC, S. Lian, XY e YL establecieron el ensayo de disociación Golf-Gβγ. YL realizó el ensayo de espectrometría de masas. KZ construyó los modos de unión de octanal y propionato dentro del bolsillo del ligando de los correspondientes receptores de olor Olfr2 y Olfr78 informados. KKZ y MZ realizaron simulaciones de dinámica molecular para ligandos dentro de las estructuras complejas mTAAR9. CZ realizó simulaciones de dinámica molecular para el modelo apo-mTAAR9 y el modelo PEA-mTAAR9-Gαsβ1γ13. LG, MZ, NR, JJ, Q. Liu, TZ, GF, Y. Zhuang, LZ e Y. Zheng prepararon las rejillas crio-EM, recopilaron los datos crio-EM para SPE–mTAAR9–Gs–scFv16, PEA– complejos mTAAR9–Gs–scFv16, PEA–mTAAR9–Golf–scFv16, DMCHA–mTAAR9–Gs–scFv16 y CAD–mTAAR9–Gs–scFv16. J.-PS escribió el manuscrito inicial. FY, Q. Li, LG, MX y XY brindaron discusiones importantes y revisiones esenciales. Y. Zheng y JC proporcionaron la Fig. 1a–c. FY, LG, YL, MX e YX proporcionaron las Figs. 1–5. FY, JC, LG, S. Lian y MZ proporcionaron cifras de datos ampliados.

Correspondencia a Yunfei Xu, Fan Yang, Qian Li o Jin-Peng Sun.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Los niveles de proteína de los receptores TAAR en la fracción de la membrana plasmática, incluidos 6 hTAAR, 13 mTAAR y 16 rTAAR que se sobreexpresaron en líneas celulares Sf9 utilizando un sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac® (Invitrogen). Los datos se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). be, La mayoría de los receptores olfativos, incluidos los TAAR, son bien conocidos por sus niveles de expresión muy bajos utilizando sistemas de expresión heterólogos, ya sea en células de insectos de baculovirus o en células HEK293 de mamíferos. Por lo tanto, analizamos los niveles de proteína de 35 miembros de TAAR en la fracción de membrana plasmática. incluidos 6 en humanos (hTAAR), 13 en ratones (mTAAR, excepto mTAAR8b y mTAAR8c) y 16 en ratas (rTAAR, excepto rTAAR8a), utilizando células de insecto Spodoptera frugiperda (Sf9) y el sistema de baculovirus Bac-to-Bac® (Invitrogen) . En particular, solo se detectaron mTAAR1, mTAAR9, rTAAR7d, hTAAR5 y hTAAR6 en la membrana plasmática, con rendimientos que oscilan entre aproximadamente 0,11 y 0,21 mg/L. f, perfiles de elución de cromatografía de exclusión por tamaño representativos de los complejos purificados mTAAR9-Golf, mTAAR1-Golf, rTAAR7d-Golf, hTAAR6-Golf y hTAAR5-Golf usando Superose 6 Increment 10/300 GL. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró que solo mTAAR9 generaba complejos homogéneos y estables con el trímero de Golf (Gβ1-Gγ2), mientras que los otros 4 complejos TAAR-Gαolf-Gβ1-Gγ2 y TAAR en complejo con Gαolf-Gβ1-Gγ13 eran inestables y a menudo se sometían a cambios constantes. disociación. Los picos de la cromatografía de exclusión por tamaño están marcados con triángulos. g, perfiles de elución de cromatografía de exclusión por tamaño representativos de los complejos mTAAR9-Gs, mTAAR1-Gs, rTAAR7d-Gs, hTAAR6-Gs y hTAAR5-Gs purificados usando Superose 6 Increment 10/300 GL. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró que solo mTAAR9 y mTAAR1 generaron complejos homogéneos y estables con el trímero Gs (Gβ1-Gγ2), mientras que los otros 3 complejos TAAR-Gs eran inestables y, a menudo, experimentaban una disociación constante. Los picos de la cromatografía de exclusión por tamaño están marcados con triángulos.

a, La potencia y eficacia de la disociación de Gα (incluidos Golf, Gs, Gi1-3, Go y Gq)-Gβγ en respuesta a la estimulación con diferentes agonistas en células HEK293 que sobreexpresan mTAAR9. El mapa de calor está coloreado según el valor de pEC50 y Emax. ND, señal no detectable. Los valores se promediaron a partir de 3 experimentos independientes para mTAAR9 (n = 3). Abreviaturas: SPE, espermidina; T1AM, 3-yodotironamina; DMCHA, N,N-dimetilciclohexilamina; IAA, isoamilamina; IBA, isobutilamina; TMA, trimetilamina; CHA, ciclohexilamina; 1-MPD, 1-metilpiperidina; PEA, β-feniletilamina; CAD, cadaverina; PTC, putrescina. b, Curvas de respuesta a la dosis de la disociación de Gα (incluidos Golf, Gs, Gi1-3, Go y Gq)-Gβγ en células HEK293 que sobreexpresan mTAAR9 en respuesta a la estimulación con diferentes agonistas de olores (SPE, SEP-363856, T1AM, DMCHA, IAA, IBA, TMA, CHA, 1-MPD, PEA, CAD y PTC). Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3).

ad, Las curvas de respuesta a la dosis de SPE (a), DMCHA (b), PEA (c) y CAD (d) indujeron la disociación de Gαs-Gβγ en células que sobreexpresan mTAAR9 o BRIL-mTAAR9. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). Para aumentar la expresión del receptor, se incorporó citocromo b562RIL (BRIL) termoestabilizado en el extremo N del mTAAR9 de longitud completa, y se descubrió que la proteína quimérica presentaba una actividad de acoplamiento de proteína G similar a la del mTAAR9 de tipo salvaje. eh, las curvas de respuesta a la dosis de SPE (e), DMCHA (f), PEA (g) y CAD (h) indujeron la disociación de Gαs-Gβγ o Gαs modificado (modGαs)-Gβγ en células que sobreexpresan mTAAR9. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). Se generó una quimera Gαs modificada (modGαs) sobre la base del andamio mini-Gs con el reemplazo del extremo N de Gs (residuo 1 al residuo 25) con Gαi1 (residuo 1 al residuo 18) para facilitar la unión de scFv16 y el reemplazo el enlazador GGGGGSGG en la posición del dominio helicoidal α de Gαs original (AHD, V65-L203) con el de Gi1 humano (G60-K180). En las células HEK293, la quimera modGαs tiene un perfil farmacológico similar en el ensayo de disociación de proteína G aguas abajo de la activación de mTAAR9 en respuesta a estimulaciones de SPE, DMCHA, PEA o CAD. il, curvas de respuesta a la dosis de SPE (i), DMCHA (j), PEA (k) y CAD (l) indujeron la disociación de Gαolf-Gβγ o Gαolf modificado (modGαolf)-Gβγ en células que sobreexpresan mTAAR9. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). Se generó una quimera de Gαolf modificada sobre la base del armazón mini-Golf con sustitución del extremo N de Golf (residuo 1 a residuo 27) con Gαi1 (residuo 1 a residuo 18) para facilitar la unión de scFv16. El modGαolf se expresó y purificó en células de insecto para estabilizar los complejos mTAAR9 para el estudio crio-EM. En las células HEK293, la quimera Gαolf modificada tiene un perfil farmacológico similar en el ensayo de disociación de proteína G aguas abajo de la activación de mTAAR9 en respuesta a SPE, DMCHA, PEA o CAD. mq, perfiles de elución representativos del complejo SPE–mTAAR9–Gs–scFv16 reconstituido in vitro (m), complejo PEA–mTAAR9–Gs–scFv16 (n), complejo PEA–mTAAR9–Golf–scFv16 (o), DMCHA–mTAAR9–Gs complejo –scFv16 (p), y complejo CAD–mTAAR9–Gs–scFv16 (q). en la columna Superose 6 Increment 10/300 y resultados SDS-PAGE representativos de los picos de cromatografía de exclusión por tamaño.

a, micrografía Cryo-EM representativa y promedios de clase bidimensionales (2D) de partículas SPE-mTAAR9-Gs (barra de escala: 100 nm). Micrografía Cryo-EM representativa de 7132 películas y promedios de clases bidimensionales representativos determinados utilizando aproximadamente 193217 partículas después de la clasificación 3D. b, Diagrama de flujo para la clasificación tridimensional (3D) de partículas SPE-mTAAR9-Gs. Se muestran micrografías Cryo-EM representativas de 7132 películas y promedios de clase 2D representativos determinados usando aproximadamente 193 217 partículas después de la clasificación 3D. Hemos realizado una máscara para el receptor solo para estructuras complejas SPE-mTAAR9-Gs. El resultado indicó que la máscara de la región del receptor en los complejos SPE-mTAAR9-Gs mejoró significativamente la calidad del mapa de la región específica de mTAAR9. c, Curvas de correlación de capa de Fourier para el mapa de densidad 3D final de partículas SPE-mTAAR9-Gs. En el límite de FSC 0,143, la resolución general del mapa es de 3,5 Å. d, mapa de densidad 3D coloreado según la resolución local (Å) del complejo trímero SPE-mTAAR9-Gs. e, micrografía Cryo-EM representativa y promedios de clase 2D de partículas PEA-mTAAR9-Gs (barra de escala: 100 nm). Micrografía Cryo-EM representativa de 8025 películas y promedios de clases bidimensionales representativos determinados utilizando aproximadamente 463012 partículas después de la clasificación 3D. f, Diagrama de flujo para la clasificación 3D de partículas PEA-mTAAR9-Gs. Se muestran micrografías Cryo-EM representativas de 8025 películas y promedios de clase 2D representativos determinados utilizando aproximadamente 463 012 partículas después de la clasificación 3D. Hemos realizado una máscara para el receptor solo para estructuras complejas PEA-mTAAR9-Gs. El resultado indicó que la máscara de la región del receptor en los complejos PEA-mTAAR9-Gs mejoró significativamente la calidad del mapa de la región específica de mTAAR9. g, Curvas de correlación de capa de Fourier para el mapa de densidad 3D final de partículas PEA-mTAAR9-Gs. En el límite de FSC 0,143, la resolución general del mapa es de 3,0 Å. h, mapa de densidad 3D coloreado según la resolución local (Å) del complejo trímero PEA-mTAAR9-Gs. i, Representación tridimensional (3D) de N-terminal, ECL1 y ECL2 de mTAAR9 en el complejo CAD-mTAAR9-Gs, Olfr78 (predicho por AlphaFold 2), β2AR (PDB: 3SN6) y D1R (PDB: 7X2F). La densidad electrónica o la densidad EM del extremo N no se observan en la estructura cristalina del complejo β2AR-Gs ni en la estructura EM del complejo D1R. Se supone que el N-terminal de β2AR y D1R está desordenado. En la estructura Olfr78 pronosticada por Alphafold2, el extremo N se inserta entre ECL1 y ECL2. Por el contrario, el extremo N de mTAAR9 atraviesa ECL1 y alcanza la punta de ECL2.

ac, se muestran mapas y modelos de densidad Cryo-EM para TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, TM7 de mTAAR9 y hélice α5 de Gαs/Gαolf en el complejo SPE-mTAAR9-Gs usando el mapa global de SPE-mTAAR9 -Gs complejo con umbral de mapa en 0,0255 (a), en el complejo PEA-mTAAR9-Gs utilizando el mapa global de PEA-mTAAR9-Gs complejo con umbral de mapa en 0,0160 (b), en el complejo PEA-mTAAR9-Golf utilizando el mapa global del complejo PEA-mTAAR9-Golf con umbral de mapa en 0,0600 (c). Cuando usamos la herramienta "Zona de color" en Chimera, establecemos el radio de color en 3 Å.

a, Resumen de los análisis del par de enlaces disulfuro C22Nter:C186ECL2 que se observó u observó potencialmente en la densidad Cryo-EM e identificado por espectrometría de masas (MS). Este enlace disulfuro conservado también fue predicho por Alphafold2 para la mayoría de los miembros de TAAR excepto para TAAR1. A pesar de que la densidad EM para las regiones extracelulares de los TAAR no fue lo suficientemente buena para identificar los posibles enlaces disulfuro en las estructuras PEA-mTAAR9-Gs y PEA-mTAAR9-Golf, nuestros datos de espectrometría de masas sugirieron que el complejo apo-mTAAR9, PEA-mTAAR9-Golf Los complejos PEA-, SPE-, DMCHA-mTAAR9-Gs y SPE-mTAAR5 tienen estos enlaces disulfuro conservados. Las densidades potenciales de Cryo-EM para el enlace disulfuro del par C22Nter:C186ECL2 en las estructuras SPE-mTAAR9-Gs y DMCHA-mTAAR9-Gs se muestran en la Fig. 9 complementaria. identificación del enlace disulfuro C22Nter:C186ECL2 par en complejo PEA-mTAAR9-Gs (b) complejo SPE-mTAAR9-Gs (c), complejo DMCHA-mTAAR9-Gs (d), complejo PEA-mTAAR9-Golf (e), apo -mTAAR9 (g) y el enlace disulfuro C24Nter:C188ECL2 par en TMA-mTAAR5 (f) por MS. NEM, netilmaleimida. h, Resumen esquemático de 3 patrones de disulfuro (incluido el par C22Nter:C186ECL2) de apo-mTAAR9 predicho por AlphaFold2. i, Efectos de las mutaciones de residuos clave del par disulfuro C14Nter:C97ECL1 y el par disulfuro C22Nter:C186ECL2 de mTAAR9, mTAAR4, mTAAR5 y mTAAR8c en las actividades del receptor inducidas por sus respectivos agonistas (SPE, PEA, TMA y 1-MPD). El mapa de calor está coloreado según el valor de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 de pEC50 mutante de tipo salvaje). ND, señal no detectable. Los valores se promediaron a partir de 3 experimentos independientes (n = 3). jm, Curvas de respuesta a la dosis de mutaciones de residuos clave de los pares disulfuro, par C14Nter:C97ECL1 y par C22Nter:C186ECL2 de mTAAR9 en sus actividades inducidas por SPE, CAD, PEA y DMCHA, respectivamente. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). np, curvas de respuesta a la dosis de mutaciones de residuos clave de los pares disulfuro, par C14Nter:C97ECL1 y par C22Nter:C186ECL2 de mTAAR8c (n), mTAAR5 (o) y mTAAR4 (p) en sus actividades inducidas por los respectivos agonistas (1-MPD , TMA y PEA). Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3).

Las densidades EM de SPE y DMCHA podrían posicionarse en 3 modos diferentes, y PEA en 2 modos potenciales en las estructuras complejas SPE-, DMCHA- y PEA-mTAAR9-Gs. Después de las simulaciones de dinámica molecular (MD), solo se utilizó 1 modo de PEA, SPE y DMCHA para realizar más análisis estructurales y caracterizaciones bioquímicas (véanse también las Figs. 11-12 complementarias). Sin embargo, el modo de unión de CAD dentro del bolsillo del ligando mTAAR9 no se pudo definir con precisión, en el que se podrían ajustar múltiples conformaciones de CAD con la densidad EM actual. a, densidad EM correspondiente a los tres modos diferentes de SPE en el complejo SPE-mTAAR9-Gs. SPE-modo 1: verde, SPE-modo 2: naranja, SPE-modo 3: azul. b, representación 3D de las interacciones detalladas entre SPE y mTAAR9 en modo 1, modo 2 y modo 3. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas rojas. c, Representación de código de barras de patrones de interacción en tres modos de unión de mTAAR9 unidos por SPE. Los residuos que interactúan con SPE se indican en círculos verdes, los que interactúan solo en el modo 1 o el modo 2 se muestran en círculos azul claro y los que interactúan solo en el modo 3 se muestran en círculos naranjas. d, La comparación de la contribución de la energía de unión de los residuos del sitio de unión de mTAAR9 en los dos modos del complejo SPE-mTAAR9-Gs según lo calculado por el método de mecánica molecular MM-PBSA57. SPE-modo 1: verde, SPE-modo 2: naranja. e, Efectos de mutaciones de residuos que interactúan en tres modos de unión a SPE de mTAAR9 en respuesta a la estimulación con SPE. El mapa de calor se colorea según el valor de ΔpEC50. Los valores fueron de 3 experimentos independientes (n = 3). Las mutaciones de residuos que interactuaron en el modo 1 pero no en el modo 3 se muestran con fondo azul claro, y las que interactúan solo en el modo 3 se muestran con fondo naranja. f, El valor promedio de RMSD de SPE y residuos del sitio de unión en los tres modos del complejo SPE-mTAAR9-Gs durante simulaciones MD de 200 ns por triplicado. En particular, el modo de unión 1 y el modo 2 de SPE fueron muy similares, excepto que el N5 de SPE en SPE-mTAAR9-G podría colocarse de manera diferente que encaja bien con la densidad EM, posiblemente debido a la configuración lineal de SPE. En comparación con el otro modo (modo 2), el modo de unión con SPE (modo 1) exhibió una energía más baja cuando el ligando estaba cerca de F1173.37 y el N5 medio estaba más cerca de Y2746.51. Además, la mutación de F1173.37A disminuyó significativamente la activación de mTAAR9 en respuesta a la estimulación con SPE. Un análisis posterior de las contribuciones de energía de unión de cada residuo ubicado en el bolsillo de unión por análisis MD confirmó que el modo de unión 1 exhibió una mayor estabilidad que la del modo 2. En el modo 3, el SPE perdió interacciones específicas con T1093.29, F1684. 61, W2716.48 y V3007.42, y formó un nuevo contacto con Y2937.35. En particular, a pesar de que la mutación Y293A no mostró efectos significativos en la activación de mTAAR9 inducida por SPE, las mutaciones de T1093.29A, F1684.61A, W2716.48A o V3007.42A redujeron significativamente o eliminaron por completo la activación de mTAAR9 inducida por SPE. Además, la simulación MD sugirió que el modo 3 es menos estable que el modo 1 y el modo 2. Por lo tanto, utilizamos principalmente el modo 1 de SPE para caracterizaciones bioquímicas adicionales.

Hemos usado AlphaFold2 para predecir la estructura de Olfr2 y Olfr78 de ratón y usamos el algoritmo SiteMap para predecir sus bolsillos de ligando correspondientes. Luego realizamos el acoplamiento molecular y la simulación MD para investigar más a fondo la interacción entre el octanal y el propionato dentro de los bolsillos de ligando de sus receptores odorantes informados, Olfr2 y Olfr78, respectivamente. a, Vista recortada del bolsillo de unión al ligando en el complejo dopamina-D1R-Gs (PDB:7CKZ, izquierda), complejo Octanal-Olfr2 generado por AlphaFold2 y simulación MD (centro) y MS47134-MRGPRX4-Gq (PDB :7S8P, derecha). b, Ilustración de las estructuras Olfr2 y Olfr78 predichas por AlphaFold2. c, Bolsillos de unión a ligandos previstos en Olfr2 (panel izquierdo) y Olfr78 (panel derecho) determinados mediante el algoritmo SiteMap. Los bolsillos de enlace predichos de Olfr2 están llenos de bolas verdes, amarillas, naranjas, cian o azules. Los bolsillos de unión predichos de Olfr78 están llenos de bolas rojas, verdes, rosas, azules o cian. d, el valor promedio de RMSD de octanal (panel superior) y residuos clave en Olfr2 que interactúan directamente con octanal (panel inferior) durante el triplicado de 200 ns de simulación MD. e, el valor promedio de RMSD de propionato (panel superior) y residuos clave en Olfr78 que interactúan directamente con el propionato (panel inferior) durante el triplicado de 200 ns de simulación MD. f, Comparación estructural del bolsillo de unión de mTAAR9 con la estructura simulada de octanal-Olfr2 de ratón y propionato Olfr78 que se generaron mediante acoplamiento molecular basado en las estructuras predichas de AlphaFold2 de Olfr2 y Olfr78. El bolsillo del ligando de ambos receptores de olores se definió mediante 4 hélices, TM3-TM6. Por el contrario, el bolsillo del ligando de mTAAR9 está definido por TM7 adicional, que potencialmente proporciona más interacciones. Otra diferencia notable es que los ligandos de mTAAR9 se unen más profundamente que los de los ligandos predichos dentro de Olfr2 u Olfr78, formando un contacto directo con el gran residuo hidrofóbico W6.48. En Olfr2 u Olfr78, el gran residuo hidrofóbico W6.48 fue reemplazado por un residuo más pequeño Y6.48 y no forma contacto directo con los ligandos correspondientes.

a, Alineación de secuencias del motivo D/E3.32-W6.48-Y7.43 en diferentes miembros TAAR humanos y de ratón. Estos 3 residuos conservados están resaltados en fondo azul claro. b, Efectos de las mutaciones de residuos clave para el motivo D/E3.32-W6.48-Y7.43 y C/S3.36 de mTAAR9, mTAAR4, 5 y 8c en respuesta a la estimulación con el agonista respectivo (SPE, PEA, TMA y 1-MPD). El mapa de calor está coloreado según el valor de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 de mutante - pEC50 de tipo salvaje). ND, señal no detectable. Los valores se promediaron a partir de 3 experimentos independientes (n = 3). c, curvas de respuesta a la dosis de mutaciones de residuos clave para el motivo D3.32-W6.48-Y7.43 y C/S3.36 de mTAAR9 (d), mTAAR8c (e), mTAAR5 (f) y mTAAR4 (g) en respuesta a la estimulación con los respectivos agonistas (SPE, 1-MPD, TMA y PEA). Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). Aunque el C/S3.36 conservado podría formar interacciones de enlace H con la cadena principal de D/E3.32, la mutación de C3.36 a A en mTAAR9, mTAAR4, mTAAR5 y mTAAR8c no causó efectos significativos en la activación inducida por olor. de estos receptores, lo que sugiere que el papel del enlace H mediado por C/S3.36 con la cadena principal de D/E3.32 es prescindible en la activación del receptor TAAR ordinario.

a, Curvas de respuesta a la dosis de la disociación de Gαs-Gβγ en células HEK293 que sobreexpresan el receptor (mTAAR1-6, 7d, 8c y 9) en respuesta a la estimulación con SPE. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). b, El valor promedio de RMSD de SPE (panel superior) y los residuos del sitio de unión en el complejo SPE-mTAAR5 durante simulaciones MD de 200 ns por triplicado. La estructura general simulada de MD se mostró en la figura complementaria 14b. Construimos las coordenadas de mTAAR5 utilizando nuestra estructura mTAAR9 resuelta como plantilla a través de SWISS-MODEL. c, representación 3D de las interacciones detalladas entre SPE y residuos D1143.32, Y2957.34 de mTAAR5. de, Curvas de respuesta a la dosis de mutaciones de residuos clave en el bolsillo de reconocimiento de poliaminas de mTAAR9 (d) y mTAAR5 (e) en respuesta a la estimulación con SPE. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). f, Representación estructural de los efectos potenciales de mutaciones estructuralmente equivalentes de mTAAR6, mTAAR7d y mTAAR8c. Las interacciones conservadas en el bolsillo de reconocimiento de poliaminas (T3.29 y T1133.33) se imitaron generando mutaciones de V1133.33 a T en mTAAR6, S1243.39 y G1283.33 a T en mTAAR7d, y S1083.29 y V1123. 33 a T en mTAAR8c. g, curvas de respuesta a la dosis de células HEK293 que sobreexpresan mTAAR6, mTAAR7d, mTAAR8c y los mutantes indicados en el bolsillo de reconocimiento de poliamina según la Fig. 4f en respuesta a la estimulación con SPE. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3).

a, La potencia y eficacia de la disociación de Gαs-Gβγ en células HEK293 que sobreexpresan el receptor (mTAAR2-6, 7d, 8c y 9) en respuesta a la estimulación con PEA. El mapa de calor está coloreado según el valor de pEC50 y Emax de 3 experimentos independientes (n = 3). ND, señal no detectable. b, Curvas de respuesta a la dosis de la disociación de Gαs-Gβγ en células HEK293 que sobreexpresan el receptor (mTAAR2-6, 7d, 8c y 9) en respuesta a la estimulación con PEA. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). c, Efectos de mutaciones de residuos clave en el bolsillo hidrofóbico de unión a SPE de mTAAR9 en respuesta a la estimulación con SPE. El mapa de calor está coloreado según el valor de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 de mutante - pEC50 de tipo salvaje). Los valores fueron de 3 experimentos independientes (n = 3). d, Curvas de respuesta a la dosis de mutaciones de residuos clave en el bolsillo hidrofóbico de unión a SPE de mTAAR9 en respuesta a la estimulación con SPE. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). Consistentemente, las mutaciones estructuralmente equivalentes de estos 4 residuos hidrofóbicos de F1173.37T, F1684.61V, Y2746.51C, V2977.39T/C y V3007.42A/G redujeron la activación de mTAAR9 inducida por SPE. ef, curvas de respuesta a la dosis de células HEK293 que sobreexpresan tipo salvaje y mutantes (F1684.61L y V3007.42A) de mTAAR9 (c) o tipo salvaje y mutantes (L170F4.61 y A2947.42V) de mTAAR5 (d) en respuesta a SPE estímulo. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). La mutación de F1684.61L y V3007.42A en mTAAR9 disminuyó la activación del receptor inducida por SPE en 5,13 ± 0,66 y 27,2 ± 5,04 veces, respectivamente (e), mientras que la mutación de L1704.61F y A2947.42V en mTAAR5 aumentó SPE- activación del receptor estimulada por 5,43 ± 0,55 y 9,26 ± 0,68 veces, respectivamente (f). Estos resultados sugieren que la unión de estos 2 residuos contribuye a la diferencia de potencia de SPE que actúa entre los 2 miembros de mTAAR. g, Efectos de mutaciones de residuos clave en el bolsillo de unión a PEA de mTAAR9 en respuesta a la estimulación con PEA. El mapa de calor está coloreado según el valor de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 de mutante - pEC50 de tipo salvaje). Los valores fueron de 3 experimentos independientes (n = 3). h, Curvas de respuesta a la dosis de mutaciones de residuos clave en el bolsillo hidrofóbico de unión a PEA de mTAAR9 en respuesta a la estimulación con PEA. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). En particular, la mutación de los cuatro residuos en mTAAR4/6/7d/9 a residuos estructuralmente equivalentes presentes en otros mTAAR, incluidos F/Y3.37L/T, Y6.51C, Y7.35L o V7.39T/C, redujo significativamente la Actividades mTAAR9 inducidas por PEA. i, Efectos de mutaciones de residuos clave en el bolsillo de unión a PEA de mTAAR7d en respuesta a la estimulación con PEA. El mapa de calor está coloreado según el valor de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 de mutante - pEC50 de tipo salvaje). Los valores fueron de 3 experimentos independientes (n = 3). j, Curvas de respuesta a la dosis de mutaciones de residuos clave de mTAAR7d en respuesta a la estimulación con PEA mediante el ensayo de disociación Gαs-Gβγ. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3). En particular, la mutación de los cuatro residuos en mTAAR4/6/7d/9 a residuos estructuralmente equivalentes presentes en otros mTAAR, incluidos F/Y3.37L/T, Y6.51C, Y7.35L o V7.39T/C, redujo significativamente la Actividades mTAAR7d inducidas por PEA.

a, Comparación de la estructura simulada de apo-mTAAR9 (cian) con el modelo de apo-mTAAR9 generado por AlphaFold2 (gris). b, El valor promedio de RMSD de apo-mTAAR9 durante 200 ns por triplicado de simulación MD. c, Comparación de la estructura crio-EM de SPE-mTAAR9 (azul) con el modelo simulado de apo-mTAAR9 (gris). Mientras que el extremo citoplásmico de TM6 en las estructuras unidas a agonistas de mTAAR9 muestra un desplazamiento significativo hacia afuera, el extremo extracelular de TM1 muestra un movimiento hacia adentro. d, Comparación estructural de TM3 y TM6 en β2AR inactivo (cian), complejo β2AR-Gs (verde claro, PDB: 3SN6), mTAAR9 inactivo (gris), complejo mTAAR9-Gs (azul claro). La comparación de las estructuras correspondientes en mTAAR9 y β2AR muestra que la interacción directa de estos agonistas con el interruptor de palanca W2716.48 empujó su movimiento hacia abajo, acompañado con un desplazamiento hacia abajo de F2676.44 y A2636.40 ubicados en dos hélices adyacentes usando TM3 como una referencia. Y el ángulo de separación entre TM3 y TM6 en mTAAR9 fue mayor que en β2AR activo debido a la sustitución de I2786.40 con β2AR por A2636.40 en mTAAR9 ya que esta sustitución interrumpe su interacción con R1303.50 conservado. e, Alineación de secuencias del miembro TAAR y miembros seleccionados de la familia GPCR de clase A en residuos clave de TM6 importantes para la activación del receptor. Los residuos conservados se resaltan con fuentes rojas. Es importante destacar que W2716.48 y F2676.44 se conservan en toda la familia TAAR, excepto que los miembros TAAR5 tienen Y6.44, lo que sugiere que los cambios conformacionales en los interruptores de palanca conservados W6.48 y F/Y6.44, así como el empaque Los cambios entre TM3 y TM6 son posibles mecanismos comunes que median la activación de TAAR acoplada a Gs/Golf. f, efectos mutacionales de A6.40, incluidos A2636.40I y A2636.40L en la actividad de mTAAR9-Golf o mTAAR9-Gs inducida por PEA, y A2576.40I y A2576.40L en mTAAR5-Golf o mTAAR5-Gs inducida por TMA la actividad se evaluó mediante el ensayo de disociación Gαs-Gβγ. El mapa de calor está coloreado según el valor de ΔpEC50 (ΔpEC50 = pEC50 de mutante - pEC50 de tipo salvaje). Los valores fueron de 3 experimentos independientes (n = 3). gj, curvas de respuesta a la dosis de mutaciones residuales para A6.40, incluidas A6.40I y A6.40L en mTAAR9 (gh) o mTAAR5 (ij) en respuesta a la estimulación con PEA o TMA mediante el ensayo de disociación Gαs/olf-Gβγ. Los valores se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes (n = 3).

a, Representación detallada de la interfaz de unión de mTAAR9 con Gs. La interfaz está compuesta por ICL2, extremos citoplasmáticos de TM3, TM5, TM6, hélice 8 de mTAAR9 (medio aguamarina) y bucle α4-β6, hélice α5, bucle β2-β3 de Gs (rosa). b, representación 3D de las interacciones detalladas entre el extremo C-terminal de la hélice α5 en el Gαs y mTAAR9. El Y391G.H5.23 y L388G.H5.20 forman contactos extensos con la superficie hidrofóbica creada por V1343.54, I2205.61, A2245.65 y Q2275.68 de mTAAR9. c, representación 3D de las interacciones detalladas entre Y391G.H5.23, E392G.H5.24, extremos carboxoxilados C-terminales de la hélice α5 de Gαs y R1303.50, K2556.32 de mTAAR9. Las distancias de enlace de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas rojas. Y391G.H5.23 participa en π: interacción catiónica con R1303.50. Los extremos de carboxilato E392G.H5.24 y C-terminal de la hélice α5 de Gαs formaron interacciones de enlace de H o carga-carga con K2556.32 de mTAAR9. d, Estructura general de la interfaz de unión del ICL2 de mTAAR9 con αN, bucle β2-β3 y hélice α5 de Gs. e, representación 3D de las interacciones detalladas entre Y140ICL2, P137ICL2, L138ICL2 de mTAAR9 y H41G.S1.02, V217G.S3.01, F376G.H5.08, C379G.H5.11, R380G.H5.11, I383G.H5 .15, Q384G.H5.16, H387G.H5.19, Y391G.H5.23 de Gαs. El P137ICL2 y L138ICL2 están ubicados en un cráter hidrofóbico creado por H41G.S1.02, V217G.S3.01, C379G.H5.11, F376G.H5.08, R380G.H5.12, I383G.H5.15 y Q384G. H5.16 de Gαs. Y140ICL2 participa en la interacción π:π con H387G.H5.19 y Y391G.H5.23. El P137ICL2 y L138ICL2 están ubicados en un cráter hidrofóbico creado por hebras β1-β3 y hélice α5 de Gαs. f, representación 3D de las interacciones detalladas entre la hélice α5 C-terminal de Gαs y el segmento inicial en el H8 de mTAAR9. Las distancias de enlace de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas rojas. g, en comparación con V287G.S5.02 en Gαs, I274G.S5.02 en Gαolf tiene una relación más estrecha con I263G.H3.12, W264G.H3.13 y F260G.H3.0. En el segmento inicial en el H8 de mTAAR9, Y3158.47 y W3178.49 constituyen una pared lateral que acomoda el extremo de gancho de la hélice α5 C-terminal de Gαs y forma un enlace de hidrógeno con R1303.50 para estabilizar la estructura activa de mTAAR9 . h, representación estructural 3D de las diferencias entre la interfaz mTAAR9-Golf (Golf en púrpura medio) y la interfaz mTAAR9-Gs (Gs en rosa). La comparación de K343G.h4s6.12/D341G.h4s6.10 en Gαolf y R356G.h4s6.12/D354G.h4s6.10 en Gαs. Las distancias de enlace de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas rojas. El K343G.h4s6.12 y D341G.h4s6.10 en Gαolf formaron interacciones carga-carga más débiles y están más separados en comparación con el par equivalente estructural R356G.h4s6.12 y D354G.h4s6.10 en Gαs. i, representación 3D de las interacciones detalladas entre V134ICL2 y V2235.64 de mTAAR9 y L375G.H5.20 y Q371G.H5.16 de Gαolf y superposición de estas interacciones con aquellas entre V134ICL2 y V2235.64 de mTAAR9 y L388G.H5. 20 y Q371G.H5.16 de Gαs. Los cambios conformacionales en los extremos citoplasmáticos de TMD permitieron una interacción más estrecha de V2235.64 y V1343.54 en mTAAR9 con Q371G.H5.16 y L375G.H5.20 en Gαolf. mTAAR9 enlazado a Gs se muestra en aguamarina medio, mTAAR9 enlazado a Golf se muestra en rosa intenso, Gs se muestra en rosa, Golf se muestra en púrpura medio. j, representación 3D de las interacciones detalladas entre R3198.51 de mTAAR9 y E379G.H5.24 de Gαolf o E392G.H5.24 de Gαs. En el extremo C de la hélice α5 de Gαolf, E379G.H5.24 forma interacciones carga-carga más fuertes con R3198.51 de mTAAR9 en comparación con las de Gαs. k, representación 3D de las interacciones detalladas entre P141ICL2, F144ICL2 de mTAAR9 y K31G.hns1.02 de Gαolf en comparación con P141ICL2, F144ICL2 de mTAAR9 y R38G.hns1.02 de Gαs (f). Las distancias de enlace de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas rojas. Aunque ICL2 de mTAAR9 forma patrones de interacción similares tanto con Gαs como con Gαolf, la sustitución de R38G.hns1.02 en Gαs por K31G.hns1.02 en Gαolf eliminó la interacción con P141ICL2 y la cadena principal F144ICL2 de mTAAR9.

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Reimpresiones y permisos

Guo, L., Cheng, J., Lian, S. et al. Base estructural de la percepción del olor a amina por un receptor olfativo de mamífero. Naturaleza 618, 193–200 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06106-4

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Recibido: 14 Octubre 2022

Aceptado: 20 de abril de 2023

Publicado: 24 mayo 2023

Fecha de emisión: 01 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06106-4

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