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Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 803 (2022) Citar este artículo

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Las expectativas para el trasplante de células madre/progenitoras neurales (NS/PC) como tratamiento para la lesión de la médula espinal (LME) están aumentando. Sin embargo, aún se desconoce si las células injertadas se incorporan al circuito neural del huésped y cómo contribuyen a la recuperación de la función motora. El objetivo de este proyecto fue establecer un novedoso sistema de imágenes in vivo no invasivo para visualizar la actividad de los injertos neurales mediante el cual podemos demostrar simultáneamente la integración a nivel de circuito entre el injerto y el huésped y la contribución de la actividad neuronal del injerto al comportamiento del huésped. . Introdujimos Akaluc, una luciferasa recién diseñada, bajo el control del elemento sensible a la actividad sináptica mejorada (E-SARE), un potente promotor sintético dependiente de la actividad neuronal, en NS/PC e injertamos las células en ratones modelo SCI. Mediante el uso de este sistema, descubrimos que la actividad de las células injertadas se integró con el comportamiento del huésped y fue impulsada por las entradas del circuito neuronal del huésped. Se espera que este sistema no invasivo ayude a dilucidar el mecanismo terapéutico del tratamiento de trasplante de células para SCI.

La lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés) da como resultado una disfunción neurológica grave, que incluye parálisis motoras, sensoriales y autonómicas. En los últimos años, se han realizado muchos intentos de desarrollar terapias de trasplante de células para promover la regeneración de la médula espinal dañada. Las células madre/progenitoras neurales (NS/PC) son algunos de los recursos más prometedores para este tipo de terapias1,2,3. Se han sugerido varios mecanismos subyacentes putativos, incluido el reemplazo celular por neuronas, astrocitos y oligodendrocitos derivados de NS/PC injertados; soporte trófico; y remielinización axonal4,5,6. Además, varios estudios han propuesto que los injertos de NS/PC pueden formar relés neuronales a través de los sitios de sección transversal de la columna7,8,9, es decir, combinar la entrada de la parte rostral del huésped al injerto y la salida del injerto a la parte caudal; se cree que estos procesos juegan un papel importante en la recuperación funcional. Sin embargo, no se ha llevado a cabo una caracterización detallada de la retransmisión neuronal, y no se comprende bien cómo se integra funcionalmente el injerto en el circuito neuronal del huésped. Esto se debe principalmente a que ninguna tecnología actual puede monitorear directamente las relaciones entre la actividad de las células de injerto y los comportamientos y actividades a nivel de circuito del huésped. Para dilucidar la coordinación funcional del injerto-huésped y evaluar cómo el injerto influye en la actividad del circuito neural del huésped y el comportamiento del huésped, se necesita una nueva técnica de imagen in vivo no invasiva para monitorear la actividad de las neuronas del injerto a lo largo del tiempo dentro del huésped vivo.

Para realizar un sistema de seguimiento in vivo de este tipo, nos centramos en dos tecnologías novedosas. El primero fue el sistema AkaBLI (una combinación de la enzima AkaLuc y AkaLumine-HCl como sustrato de alta permeabilidad)10,11. La formación de imágenes por bioluminiscencia (BLI) es un método no invasivo para medir la salida de luz de las células que expresan la enzima luciferasa después de la administración de luciferina (sustrato) en animales vivos12. AkaBLI es un sistema BLI desplazado hacia el rojo recientemente desarrollado que produce espectros de emisión brillantes y permite obtener imágenes de tejido profundo en animales vivos10, que es el más adecuado para el control no invasivo de campo amplio de la expresión génica de células de injerto en médulas espinales lesionadas. El segundo fue el elemento sensible a la actividad sináptica mejorada (E-SARE), un potente promotor sintético dependiente de la actividad neuronal13. Cuando una neurona se vuelve activa, activa genes tempranos inmediatos (IEG), como Fos, Arc y Egr1, incluso en las neuronas de la médula espinal, y los promotores/potenciadores de los IEG se utilizan como sistemas informadores dependientes de la actividad14,15. Entre estos promotores se encuentra el promotor sintético E-SARE, que se basa en el elemento potenciador SARE del promotor Arc e impulsa la expresión génica dependiente de la actividad neuronal significativamente superior a la de cualquier otro promotor IEG existente.

En este estudio, combinamos la tecnología AkaBLI y E-SARE y establecimos un novedoso sistema no invasivo para visualizar la actividad neuronal del injerto in vivo. Logramos obtener imágenes de la dinámica del conjunto activo de células derivadas de NS/PC injertadas en médulas espinales lesionadas. Usando este sistema, confirmamos que la actividad del injerto está vinculada al comportamiento del huésped y que el circuito del huésped regula la actividad del injerto.

Para establecer un sistema basado en bioluminiscencia para visualizar la actividad neuronal, primero construimos un vector lentiviral para la expresión de AkaLuc, una luciferasa optimizada para la bioluminiscencia desplazada hacia el rojo, bajo el control de E-SARE, un potente promotor dependiente de la actividad neuronal generado a partir del potenciador Arc. elementos (Fig. 1a). Llamamos a este sistema ESAL (E-SARE-AkaLuc). En el sistema ESAL, también fusionamos AkaLuc con la proteína Venus para el marcaje fluorescente simultáneo y con la secuencia PEST para acortar la vida media de la proteína de fusión16. La proteína Venus es una proteína fluorescente amarilla (YFP) derivada de Aequorea victoria que contiene una mutación que provoca una maduración rápida y una mayor resistencia ambiental17. Luego transfectamos el vector lentiviral ESAL en NS / PC derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC), identificadas como ESAL-NS / PC, e inducimos la diferenciación de las células en neuronas (Fig. 1b-h). Cuando se estimularon con una concentración despolarizante de cloruro de potasio (50 mM), las neuronas derivadas de ESAL-NS/PC mostraron aumentos significativos en los recuentos de fotones de AkaLuc en comparación con los controles no estimulados (Fig. 1b, c). También detectamos aumentos en la fluorescencia de Venus y la expresión de IEG tras la estimulación con KCl 50 mM (Fig. 1d, e). Por lo tanto, confirmamos que el sistema ESAL era muy sensible a la estimulación despolarizante en las neuronas, pero mostró poca respuesta en las células no neuronales (Fig. 1f-h). Estos datos sugieren que el sistema ESAL se puede utilizar para controlar con éxito la actividad neuronal de las neuronas derivadas de NS/PC.

una ilustración esquemática de la construcción E-SARE-Venus-AkaLuc (ESAL), que se usó para expresar la enzima luminiscente AkaLuc fusionada con Venus bajo el control del promotor E-SARE. Cuando se activó una neurona, el promotor E-SARE impulsó una alta expresión del gen informador aguas abajo Venus-AkaLuc. b Imagen de bioluminiscencia comparativa (BLI) de células cultivadas in vitro estimuladas con KCl 50 mM durante 6 h (a la derecha, n = 4) o sin estimulación (a la izquierda, n = 4) a la izquierda. Preparamos n = 8 pocillos de dos neuroesferas terciarias independientes del mismo cuerpo embrioide (EB). El color de las barras indica la radiación de bioluminiscencia total (fotones/seg/cm2/str). El estereorradián (str) es la unidad del ángulo sólido. c Análisis cuantitativos de la intensidad de señal relativa de BLI de células derivadas de ESAL-NS/PC con o sin la adición de KCl 50 mM in vitro (n = 4 cada una). Los valores son la media ± error estándar de la media (SEM): **p < 0,01. Se realizó una prueba t de Student no pareada bilateral. Valor de T y grados de libertad: t (6) = 11,59, p = 2,5 × 10−5. d Imagen microscópica de campo brillante e imagen de fluorescencia de Venus de células derivadas de ESAL-NS/PC con o sin la adición de KCl 50 mM in vitro. Barra de escala, 50 μm. e Los resultados de los análisis de qPCR de la expresión génica de Venus, ARC y FOS en células dentro del mismo pozo como se muestra arriba (n = 4 cada uno). Los valores son la media ± SEM: *p < 0,05, **p < 0,01. Se realizó una prueba t de Student no pareada bilateral. Valores individuales de t y grados de libertad: Venus t(6) = 3,034, p = 0,023. Arco t(6) = 2,705, p = 0,035. Fos t(6) = 7,057, p = 4,1 × 10−4. f, g Imágenes representativas de células diferenciadas que expresan Venus de NS/PC teñidas para una visión anómala letal panembriónica (pan-ELAVL) (neuronas) con o sin la adición de KCl 50 mM (f); teñido para proteína ácida fibrilar glial humana (GFAP) (astrocitos), 2ʹ, 3ʹ -nucleótido cíclico 3ʹ-fosfodiesterasa (CNPasa) (oligodendrocitos), Nestin y Ki-67 (células inmaduras) con la adición de KCl 50 mM (g). Barra de escala, 20 μm. h Porcentaje de células positivas para marcadores específicos de tipo celular entre las células Venus+ después de la estimulación con KCl 50 mM.

Para perfilar la resolución temporal del sistema ESAL, examinamos el curso temporal de la bioluminiscencia después de un breve período de estimulación neuronal (4-aminopiridina [4AP] + bicuculina [BIC]) que facilita la activación del potencial de acción y potencia la transmisión glutamatérgica (Fig. 1a). La bioluminiscencia dependiente de la actividad neuronal se detectó aproximadamente 4 h después de la estimulación, alcanzó su punto máximo a las 6 h y volvió al nivel basal a las 24 h (Fig. 1b complementaria). Estos resultados indican que un aumento en la bioluminiscencia en el sistema ESAL refleja la actividad neuronal acumulada que persistió durante un período que va de 4 a 10 h antes de la medición de BLI.

A continuación, los ratones NOD/ShiJic-scidJcl (NOD-SCID) se sometieron a una sección de la columna dorsal C5 a nivel espinal ya un trasplante 9 días después de la lesión. Consideramos que el entorno del huésped es el más adecuado para el trasplante en este momento porque la inflamación aguda después de la SCI ha disminuido, mientras que la formación de la cicatriz glial aún no se ha completado18,19,20,21. Se trasplantaron ESAL-NS/PC en los sitios de lesión (Fig. 2a, f). Descubrimos que la fuerza de agarre normalizada por el peso corporal y la puntuación IBB habían mejorado significativamente más en el grupo TP que en el grupo PBS (Figuras complementarias 2a, b). Sin embargo, no se encontraron cambios significativos relacionados con la recuperación en la tasa de error para la prueba de escalera horizontal (Fig. 2c complementaria).

a Ilustración esquemática de los ratones de control positivo. El trasplante de NS/PC doblemente infectados con los dos virus (CAG-hM3Dq-mCherry, que contiene una proteína de fusión hM3Dq y mCherry, y ESAL se transdujeron en NS/PC a través de lentivirus) se realizó 9 días después de la sección transversal de la columna dorsal C5. Seis semanas después del trasplante, se realizaron mediciones de luminiscencia antes del sacrificio. b Comparación de las proporciones de la intensidad de la señal BLI (7 h post-CNO/pre-CNO) entre ratones trasplantados con NS/PC que expresan ESAL (trasplantados con ESAL-NS/PC) (hM3Dq [−] TP, n = 4) y ratones trasplantados con NS/PC doblemente infectados (hM3Dq [+] TP, n = 3). Los valores son la media ± SEM: *p < 0,05. Se realizó una prueba t de Student no pareada bilateral. Valor de T y grados de libertad: t(5) = 3,977, p = 0,011. c Imágenes representativas de IVIS de un ratón de control positivo (pre y post-CNO). El círculo muestra la región de interés (ROI) en la columna cervical. El color de las barras indica la radiación de bioluminiscencia total (fotones/seg/cm2/str). d, e Imágenes representativas de un ratón de control positivo 6 semanas después del trasplante; etiquetados con Venus (verde), mCherry (rojo) y HNA (células humanas) (azul) (d) o etiquetados con Venus (verde), Fos (rojo) y HNA (azul) (e). Barras de escala, 20 μm. f Ilustración esquemática de experimentos in vivo. El trasplante de ESAL-NS/PC se realizó 9 días después de la sección transversal de la columna dorsal de C5. Tres, 6 y 9 semanas después del trasplante, se realizaron mediciones de luminiscencia. Todos los ratones fueron sacrificados 10 semanas después del trasplante. g Imágenes representativas de células injertadas de un ratón trasplantado con ESAL-NS/PC marcado con Venus (verde), pan-ELAVL (rojo; puntas de flecha) y HNA (azul). Barras de escala, 20 μm. h Cambio dependiente del tiempo en la intensidad de la luminiscencia del injerto de ratones trasplantados con ESAL-NS/PC a las 3, 6 y 9 semanas después del trasplante (n = 12 ratones). Los valores son la media ± SEM: *p < 0,05. NS: no significativo. Se realizó un ANOVA de medidas repetidas. Valores de p individuales: semanas 3 y 6; 0,1735, semanas 6 y 9; 0,2007, semanas 3 y 9; 0.0035. i Imágenes representativas de células injertadas de tejidos de ratón trasplantados con ESAL-NS/PC marcados con Venus (verde), APC (oligodendrocitos), GFAP (astrocitos), Ki-67/Nestin (rojo; puntas de flecha) y HNA (azul). Barras de escala, 20 μm.

Para manipular artificialmente la actividad neuronal en las células injertadas, introdujimos hM3Dq, un receptor quimiogenético estimulador y receptor de diseño activado exclusivamente por drogas de diseño (DREADD), que permitió activar el injerto tras la administración de su ligando22,23 en ESAL-NS/ PC (Fig. 2a). Cuando los injertos se activaron mediante la administración del N-óxido de clozapina (CNO) del ligando hM3Dq, la bioluminiscencia aumentó significativamente (Fig. 2b, c). De manera consistente, en los análisis inmunohistoquímicos, la expresión de la proteína Venus se detectó exclusivamente en las células que expresan hM3Dq, mientras que las células de injerto mCherry+ expresaron principalmente la proteína Venus tras la activación de CNO (Fig. 2d). Para confirmar que esto ocurrió porque la eficacia de transfección lentiviral fue muy alta, calculamos la eficiencia de transfección de ESAL y DREADD en NS/PC a través de un vector lentiviral in vivo. En primer lugar, la eficiencia de transfección de hM3Dq bajo un promotor ubicuo, es decir, la población de células mCherry+ a partir de células con antígeno de neutrófilo humano (HNA)+, fue del 90,0 ± 1,1 % (Fig. 2d, Fig. 2d complementaria) (de n = 3 animales). En segundo lugar, la eficiencia de expresión de ESAL se aproximó de acuerdo con la población de células Venus+ mCherry+ doblemente positivas a partir de células mCherry+ bajo activación ubicua de CNO. Se determinó que el porcentaje de Venus+mCherry+/mCherry+ era del 83,9 ± 2,5 % (Fig. 2d, Fig. 2d complementaria) (de n = 3 animales). En general, se consideró que las eficiencias de transfección eran lo suficientemente altas para interpretar los resultados de la bioluminiscencia. De acuerdo con esto, las células Venus+ a menudo eran inmunopositivas para Fos, un marcador y un IEG (68,9 ± 3,0 %) (Fig. 2e), a pesar de que la proteína Fos se regula inmediatamente por la actividad neuronal y es un factor de transcripción de corta duración24,25 . Estos datos sugirieron que el sistema ESAL etiquetó con éxito conjuntos activos en neuronas injertadas en ratones modelo SCI.

El porcentaje de células neuronales positivas para ELAVL (Hu) humano fue muy alto entre las células positivas para Venus (76,2 ± 8,6%) (Fig. 2e complementaria). Incluso sin activación artificial por hM3Dq, encontramos expresión de Venus en una porción de injertos neuronales (Fig. 2f, g). Este hallazgo sugiere que el sistema ESAL puede informar de neuronas que muestran actividad espontánea en el injerto. Esto está en línea con el curso temporal de la elevación de la bioluminiscencia de ESAL medida cronológicamente después del trasplante de ESAL-NS/PC, lo que sugiere que una progresión de diferenciación neuronal y maduración de NS/PC precede a un aumento significativo en la detección de bioluminiscencia (Fig. 2h). De acuerdo con esta idea, confirmamos que pocas células gliales exhibieron expresión de Venus (GFAP+/Venus+, 4,0 ± 1,5 %; APC+/Venus+, 3,3 ± 2,5 %) (Fig. 2i).

Informes anteriores sugirieron que después de una lesión en el tracto neuronal del huésped, las neuronas injertadas se integran y se vuelven parte del circuito dentro del tracto9,26. Usando el sistema ESAL, examinamos el efecto de la actividad del huésped en la actividad del injerto neuronal a nivel individual y de circuito. Primero, monitoreamos la bioluminiscencia de ESAL durante el día y descubrimos que la bioluminiscencia de ESAL era más alta alrededor del mediodía y más baja por la noche (Fig. 3 complementaria). Dado que la bioluminiscencia de ESAL refleja la actividad neuronal acumulada aproximadamente 6 h antes de la observación (Fig. 1 a, b complementaria), este resultado indica que la actividad neuronal del injerto tiene variaciones diurnas consistentes con la actividad máxima y mínima de los animales huéspedes durante los períodos nocturno y diurno. , respectivamente. Para determinar aún más cuánto influye la actividad del huésped en la actividad del injerto a nivel individual, luego utilizamos anestesia a largo plazo (con una combinación de midazolam, clorhidrato de medetomidina y butorfanol) para imitar el sueño (Fig. 3a). La tasa de respiración de los ratones sugirió que la anestesia estuvo activa durante al menos 6 horas después de la administración. Para aumentar el tiempo anestésico a 9 h, administramos adicionalmente isoflurano durante las 3 h restantes. La bioluminiscencia ESAL disminuyó a casi la mitad del nivel inicial después de la anestesia a largo plazo (Fig. 3b, c). Esta disminución fue significativa tanto a las 6 como a las 9 semanas posteriores al trasplante (Fig. 3c). Además, buscamos confirmar que la mezcla de tres tipos de agentes anestésicos no podría alterar directamente la actividad de las neuronas del injerto utilizando neuronas cultivadas in vitro. De hecho, la intensidad de la señal de BLI no se redujo notablemente por los agentes anestésicos (Fig. 3d, e). En conjunto, estos datos implican que la actividad neuronal del injerto está asociada con las actividades diarias de los huéspedes a nivel individual.

a Ilustración esquemática de la anestesia continua a largo plazo. La anestesia se logró con una mezcla de tres tipos de agentes anestésicos (butorfanol, clorhidrato de medetomidina y midazolam) seguida de anestesia por inhalación hasta por 9 h. b Imágenes IVIS representativas de un ratón trasplantado con ESAL-NS/PC antes y después de la anestesia continua a largo plazo 10 semanas después del trasplante. El círculo muestra la región de interés (ROI) en la columna cervical. El color de las barras indica la radiación de bioluminiscencia total (fotones/seg/cm2/sr). c La proporción de la intensidad de la señal de BLI (antes y 9 h después de la anestesia continua) a las 6 y 9 semanas después del trasplante (n = 5 ratones). Los valores son la media ± SEM: *p, #p < 0,05. Se realizaron pruebas t de Student pareadas bilaterales. Valores individuales de t y grados de libertad: semana 6 y 9; t(8) = 2,754, p = 0,025, semana 6; t(8) = 2,502, p = 0,037, semana 9; t(8) = 4,456, p = 2,1 × 10−3. d BLI comparativo de células cultivadas in vitro con (n = 4) o sin (n = 4) la adición de agentes anestésicos mixtos en dos concentraciones diferentes, 12/3/10 μM ("Concentración baja") y 30/7,5 /25 μM ("Alta concentración"), durante 6 h (n = 4, 4 cada uno). Preparamos n = 8 pocillos de dos neuroesferas terciarias independientes del mismo EB. El color de las barras indica la radiación de bioluminiscencia total (fotones/seg/cm2/str). e Análisis cuantitativos de la intensidad de señal relativa de BLI de células derivadas de ESAL-NS/PC con o sin la adición de agentes anestésicos mixtos in vitro (n = 4, 4 cada uno). Los valores son la media ± SEM: NS: no significativo. Se realizaron pruebas t de Student no apareadas bilaterales. Valores individuales de t y grados de libertad: izquierda: t(6) = 0,342, p = 0,744, derecha: t(6) = 1,821, p = 0,118.

A continuación, investigamos si la actividad a nivel del circuito del huésped regula directamente la actividad neuronal del injerto y en qué medida. Nos enfocamos en el tracto corticoespinal (CST), uno de los principales circuitos descendentes que juega un papel fundamental en el control sensoriomotor, y manipulamos artificialmente la actividad del CST mediante la inyección de la corteza motora con un virus adenoasociado (AAV) que codifica hM3Dq-mCherry bajo el control del promotor de la sinapsina I humana (Fig. 4a). Tres o cuatro semanas después de la inyección de AAV27, confirmamos que hM3Dq-mCherry permitía un marcaje anterógrado eficiente en el sitio de la lesión C5 a través del CST (Fig. 4b). Este etiquetado selectivo de las proyecciones de CST en el sitio de la lesión sugirió que las fibras de CST inervaban el injerto (Fig. 4c, Fig. 5 complementaria). De hecho, encontramos que se habían formado sinapsis de huésped a injerto (Fig. 4d-g, Fig. 6a-c complementaria), indicativo del control del injerto impulsado por CST. Para probar esto directamente, el CST se activó mediante la administración del ligando hM3Dq CNO, y detectamos un aumento inducido por la actividad en la expresión de Venus fusionado con AkaLuc en células de injerto mediante análisis inmunohistoquímicos (Fig. 4h-j). Además, el aumento en la actividad del injerto inducido por la estimulación artificial de CST tras el tratamiento con CNO también se confirmó in vivo mediante mediciones de BLI a través de un aumento en el recuento de fotones ESAL del injerto (Fig. 4h, k, l). Estos resultados sugieren que las entradas de CST del huésped inervan y regulan la actividad del injerto.

una ilustración esquemática que representa el calendario de los experimentos in vivo. Seis semanas después del trasplante de ESAL-NS/PC, los ratones se sometieron a una inyección de AAV en la corteza motora. Diez semanas después del trasplante, se realizaron mediciones de luminiscencia antes del sacrificio. b Confirmación de cuerpos celulares marcados con mCherry en la corteza cerebral (barras de escala, 250 μm) y axones marcados con mCherry en el bulbo raquídeo (barras de escala, 500 μm) y médula espinal cervical en el nivel 1/2 (barras de escala, 100 μm ). Se observaron extremos de axón de mCherry+ CST en la materia gris rostral al área lesionada de C5 (barras de escala, 250 μm), y se observaron pocos axones de CST caudales a la lesión (barras de escala, 250 μm). R: derecha, L: izquierda, D: dorsal y V: lado ventral. c Imágenes sagitales representativas a 400 μm del plano sagital medio alrededor de la médula espinal lesionada. Las células trasplantadas se tiñeron con STEM121 (un marcador citoplasmático específico de humanos) y el CST se marcó con mCherry. Línea discontinua, límite rostral del injerto, R: rostral, C: caudal, D: dorsal y V: lado ventral. Barras de escala, 5 μm. d Vista de gran aumento de la formación de sinapsis entre los axones CST y las neuronas injertadas. El marcador presináptico sinaptofisina se fusionó con mCherry y estaba adyacente a una célula STEM121+. Barras de escala, 2 μm. e Vista de gran aumento de la formación de sinapsis entre los axones CST y las neuronas injertadas. El marcador postsináptico pAMPAR se fusionó con STEM121 y estaba adyacente a una célula mCherry+. Barras de escala, 2 μm. f Gráfico de barras que muestra la cuantificación de las sinapsis de sinaptofisina+ combinadas con mCherry integradas en el área STEM121+ en cada grupo trasplantado (grupo de activación de CST, 20 imágenes/n = 4; grupo de no activación de CST, 20 imágenes/n = 4). Los valores son la media ± SEM: *p < 0,05. Se realizó una prueba t de Student no pareada bilateral. Valor de T y grados de libertad: t(38) = 0,128, p = 0,90. g Imagen microscópica inmunoelectrónica doble de la conexión sináptica entre una neurona CST mCherry+ con tinción de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB) y una neurona de injerto Venus+ con tinción Immunogold. El marcaje anti-mCherry se localizó en la membrana de la neurona CST y las proteínas de Venus se detectaron como puntos negros, principalmente en la membrana citoplasmática. Puntas de flecha, densidad postsináptica. Barra de escala, 500 nm. h Ilustración esquemática que demuestra que la CST del huésped ingresa a los injertos de células madre neurales en sitios de lesión de la médula espinal C5. Cuando las neuronas CST se activan a través de hM3Dq, las neuronas injertadas interconectadas con axones CST regenerados son capaces de obtener el promotor E-SARE, lo que impulsa una alta expresión del gen informador aguas abajo Venus-AkaLuc. R: rostral, C: caudal, D: dorsal y V: lado ventral. i Imágenes representativas de la médula espinal cervical axial de tinción de Venus y HNA en tejido de ratones con o sin activación de CST. Las secciones mostradas se derivaron en el mismo orden a lo largo del eje rostro-caudal. Barras de escala, 1000 μm. Venus es una proteína citoplasmática, mientras que HNA es un antígeno antinuclear. j Comparación del volumen calculado de Venus+/volumen de HNA+ entre los grupos trasplantados (grupo de activación de CST, n = 4; grupo de no activación de CST, n = 4). Se usó un anticuerpo anti-GFP para marcar la proteína Venus. Los valores son la media ± SEM: *p < 0,05. Se realizó una prueba t de Student no pareada bilateral. Valor de T y grados de libertad: t(6) = 2,573, p = 0,042. k Imágenes representativas de IVIS de un ratón trasplantado con ESAL-NS/PC antes y después de la activación de CST (el mismo individuo que se muestra en la Fig. 4i [derecha]). El círculo muestra la región de interés (ROI) en la columna cervical. El color de las barras indica la radiación de bioluminiscencia total (fotones/seg/cm2/str). l Comparación de la intensidad de la señal de BLI para ratones trasplantados con ESAL-NS/PC con o sin activación de CST para cada ratón 10 semanas después del trasplante (n = 10 ratones). Los valores son la media ± SEM: **p < 0,01. Se realizó la prueba de la t de Student pareada bilateral. Valor de T y grados de libertad: t(18) = 2,963, p = 8,3 × 10−3.

¿Cuánto tiempo después del trasplante aumentan las entradas de CST para inervar las neuronas injertadas? Para responder a esta pregunta, se midió longitudinalmente la bioluminiscencia de los injertos inervados por neuronas CST. Curiosamente, la relación señal-ruido (activación post-/pre-CST) aumentó significativamente de las semanas 3 a 9 y de las semanas 6 a 9, lo que sugiere que las entradas de CST del huésped inervan y regulan la actividad del injerto, especialmente después de la semana 6 (Fig. 4a).

¿Cómo se realiza el curso temporal de la actividad de ESAL después de la administración de CNO? Un efecto inicial de la administración sistémica de CNO sobre la actividad neuronal comienza después de 5 a 10 minutos y alcanza su punto máximo a los 45 a 50 minutos después de la administración de CNO28,29,30. Teniendo en cuenta que el lapso de tiempo revelado por este estudio in vitro fue de 6 h desde la conducción del promotor ESARE hasta el pico de expresión de la proteína informadora de ESAL, todas las mediciones anteriores se realizaron 7 h después de la administración de CNO (Figura complementaria 4b). Para la validación, realizamos mediciones de recuento de fotones ESAL a las 4, 7 y 10 h después de la administración de CNO, rastreando el mismo animal individual en diferentes días. De acuerdo con los resultados del estudio in vitro, la relación del recuento de fotones promedio por estado inicial fue la más alta a las 7 h entre los tres puntos de tiempo (4, 7 y 10 h), aunque la diferencia entre las relaciones de recuento de fotones a las 4 h y 7 h por estado inicial no fue significativo (Fig. 4c complementaria).

Aquí, desarrollamos un nuevo sistema de bioimagen, ESAL, mediante la combinación de una bioluminiscencia desplazada hacia el rojo sensible y precisa, AkaBLI, y el promotor dependiente de la actividad neuronal E-SARE. Este sistema ESAL etiqueta eficientemente las neuronas activas en injertos neurales en la médula espinal lesionada. Mediante el uso de este sistema de imágenes ESAL no invasivo, hemos demostrado la asociación directa entre la actividad del injerto y la actividad a nivel del circuito/comportamiento del huésped.

Los resultados de este estudio demuestran que el sistema ESAL es un método no invasivo para obtener imágenes in vivo de la actividad del injerto en la médula espinal lesionada. El sistema ESAL puede visualizar la actividad neuronal espontánea y revelar la interacción entre el injerto y los circuitos neuronales del huésped. Aunque algunos grupos han informado sobre la conectividad huésped-injerto en modelos SCI utilizando técnicas electrofisiológicas31 o de imágenes de calcio9, sus experimentos no se realizaron en animales SCI vivos. Por el contrario, el sistema ESAL se puede utilizar de forma completamente no invasiva y demostramos in vivo que la actividad del huésped a nivel individual, como el sueño y la anestesia a largo plazo, influye directamente en la actividad del injerto.

La retransmisión neuronal es un mecanismo central a través del cual el trasplante de NS/PC se puede utilizar para tratar SCI9,31,32. Los circuitos de retransmisión se pueden establecer entre los axones descendentes del huésped y las neuronas recién diferenciadas de los NS/PC trasplantados. Sin embargo, la falta de métodos de medición in vivo no invasivos ha impedido la aclaración de cómo los injertos neurales se integran funcionalmente en los circuitos del huésped y cómo la actividad del injerto contribuye a la recuperación del comportamiento. Nuestro sistema ESAL puede monitorear la actividad del injerto en el contexto de varios comportamientos del huésped, lo que permite dilucidar el mecanismo de formación de relés neuronales y su contribución a la recuperación funcional.

La intensidad de la bioluminiscencia de las células derivadas de NS/PC aumentó continuamente hasta 9 semanas después del trasplante, lo que sugirió que la actividad del injerto espontáneo aumentó concomitantemente. Esto está en consonancia con un estudio previo de nuestro grupo que sugiere que se requieren más de 6 semanas para la maduración neuronal en los injertos33. Varios informes que utilizan organoides cerebrales derivados de iPSC humanos también han indicado que la formación de sinapsis y la actividad espontánea comienzan a las 4-6 semanas34. Según los hallazgos de otros y los nuestros, los resultados del sistema ESAL podrían reflejar la maduración neuronal y la formación de sinapsis in vivo.

Queda el debate sobre qué subtipos de NS/PC con diferentes identidades regionales son los más apropiados para la terapia celular31,35,36. El sistema ESAL permitirá determinar la calidad y la idoneidad de varios subtipos de NS/PC integrados en el host. La forma en que los injertos contribuyen a una mayor regeneración tisular y la restauración de la función motora sigue siendo difícil de comprender. Informes anteriores han demostrado que el pretratamiento con un inhibidor de la γ-secretasa (GSI) promueve la maduración de las neuronas derivadas de NS/PC al inhibir la señalización de Notch;21 además, los antagonistas del receptor Nogo facilitan la regeneración del tracto rafeespinal37, y se ha sugerido que algunos organizadores de sinapsis formación de sinapsis38. Este sistema también será valioso para evaluar los efectos de estos componentes moleculares en los injertos de NS/PC y los circuitos del huésped alrededor de la médula espinal lesionada.

Por lo tanto, este sistema ESAL tiene el potencial de revelar la contribución de entrada sináptica de cada vía descendente para injertar neuronas en la recuperación de la función motora. Las funciones del CST incluyen el control de las entradas aferentes, los reflejos espinales y la actividad de las neuronas motoras39. Además, el CST es generalmente reconocido como la vía motora principal para los movimientos voluntarios en humanos40. En roedores, el CST controla solo la capacidad de agarre que involucra flexores digitales, que depende en gran medida del CST dorsal y dorsolateral, así como de la escalera horizontal o tareas de alcance hábil41,42. Según estudios previos, el tracto rubroespinal o reticuloespinal puede ser más importante que el CST para la función motora en roedores43,44. Sería interesante verificar el lugar del trasplante utilizando este sistema para potenciar el efecto de la terapia celular.

En conclusión, este estudio presenta un nuevo sistema in vivo para monitorear las neuronas derivadas de células injertadas y proporciona información importante sobre la importancia del vínculo entre la actividad del injerto y el circuito y el comportamiento neuronal del huésped. Demostramos in vivo que la conectividad sináptica de huésped a injerto se estableció funcionalmente después del trasplante de NS/PC para SCI. Una forma de mejorar la terapia celular sería mejorar aún más esta conectividad. Promover la maduración neuronal o la formación de sinapsis podría hacer que la terapia celular con este sistema sea más efectiva en el futuro.

Tanto la activación de la CST/injerto como el registro de la actividad del injerto dependían de la expresión viral de hM3Dq y ESAL. Las variaciones en las eficiencias de transfección/expresión podrían afectar los análisis de integración de las células de injerto dentro de la CST huésped. Las bajas eficiencias de transfección también podrían dificultar la interpretación de los resultados con respecto a la actividad ESAL. Aunque el CST es el componente principal que contribuye al control motor, reconocemos que una estimulación CST de una sola vez no es suficiente para mejorar el comportamiento de los ratones dado que no se supone que se altere la plasticidad neuronal. En cambio, una estimulación hM3Dq consecutiva de la CST puede lograr una mejora simultánea del circuito/actividades conductuales que mejoran la actividad sináptica45,46. Además, la inactivación de la función CST por CST-DREADD ayudaría mejor a proporcionar evidencia de la conectividad del huésped al injerto47.

Es importante tener en cuenta que este sistema no proporciona una evaluación en tiempo real de la actividad neuronal en curso, sino que necesita una mayor actividad durante varias horas para mostrar un efecto, lo que refleja la actividad neuronal acumulada. Una solución para mejorar la resolución temporal es utilizar un indicador de actividad neuronal en tiempo real, como la concentración de calcio intracelular. De hecho, se ha informado sobre un sistema de luciferasa dependiente de calcio, Orange CaMBI48. Sin embargo, este sistema se basa en NanoLuc-furimazina y podría no ser apropiado para injertos neurales debido a su baja permeabilidad del sustrato a través de la barrera hematoencefálica49,50. Otra posible solución es el uso de otro promotor dependiente de la actividad, como el promotor Fos51, que es un promotor dependiente de la actividad de uso común que está regulado a un nivel muy bajo debido a la autorrepresión de la transcripción de Fos por la proteína Fos52,53. Por lo tanto, para amplificar la expresión dependiente del promotor de Fos, generalmente se agrega un sistema inducible por tet debido a la activación transcripcional por tetraciclina10. Sin embargo, este sistema de doble informador Fos-tet requiere un tiempo considerable para la expresión génica. Por el contrario, el sistema ESAL impulsa la expresión del reportero a un nivel lo suficientemente alto como para usarse solo para el control de injertos, logrando la expresión génica en un período relativamente corto.

Aunque nos hemos centrado principalmente en la conexión de injerto a huésped entre las neuronas descendentes del huésped y el injerto, se necesitan más estudios para evaluar la interacción de injerto a huésped entre el injerto y las neuronas espinales del huésped, como las neuronas motoras. El sistema ESAL está disponible no solo para injertos, sino también para las neuronas huésped mediante el uso de AAV, porque ESAL se puede empaquetar en un solo AAV debido a su pequeño tamaño. Por ejemplo, sería factible detectar la actividad de las neuronas motoras espinales mediante la transfección de un vector viral retrógrado AAV en la unión neuromuscular54. Los estudios futuros ampliarán nuestra comprensión de la interacción mutua entre el huésped y el injerto.

Para construir un vector lentiviral para ESAL, el promotor E-SARE (como se describe en la Ref. 10, y disponible a pedido de H. Bito en el Departamento de Neuroquímica, Facultad de Medicina de la Universidad de Tokio) y Venus-AkaLuc-PEST cDNA (obtenidos de un plásmido que recibimos con un MTA del RIKEN BRC [centro de recursos biológicos]) se clonaron en el vector lentiviral CSII. Para construir un vector lentiviral para la activación ubicua de DREADD, el ADNc de hM3Dq-mCherry se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de pAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry (plásmido Addgene n.° 50474) y se transfirió al vector lentiviral CSIV con el CAG promotor, que es una construcción híbrida que consta del potenciador de citomegalovirus (CMV) fusionado con el promotor de beta-actina de pollo55.

Los vectores lentivirales recombinantes se produjeron por transfección transitoria de tres plásmidos en células HEK 293T: pCAG-HIVgp, pCMV-VSV-G-RSV-Rev, y el vector lentiviral CSII-E-SARE-Venus-AkaLuc-PEST o CSIV-CAG- hM3Dq-mCherry56,57,58.

El Centro de Investigación y Aplicación de Células iPS (CiRA) nos proporcionó células pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) generadas y mantenidas en condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP). Las NS/PC se generaron a partir de la línea iPSC humana 414C259 mediante métodos descritos anteriormente21,33,60. Brevemente, se cultivaron iPSC humanas 414C2 durante 12 días en cultivo de adhesión con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). Luego, se generaron cuerpos embrioides (EB) a partir de iPSC cultivadas en suspensión durante 30 días. Luego, los EB se disociaron en células individuales utilizando TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.) y se diferenciaron en suspensión a una densidad de 1,0 × 105 células/ml en medio de células madre neurales KBM (Kohjin Bio, Saitama, Japón) complementado con B-27 (Thermo Fisher Scientific), 20 ng/ml de FGF-2 (PeproTech, NJ, EE. UU.) y 10 ng/ml de factor inhibidor de la leucemia humana (hLIF; Merck KGaA, Hesse, Alemania) durante 12 días. Se añadió FGF-2 cada 3 días y todos los medios de cultivo celular se cambiaron cada 6 días. Estas neuroesferas primarias se pasaron cada 10 a 14 días disociándolas de la misma manera que se describe anteriormente. Después del primer pase, se realizó la infección lentiviral en cultivo durante 3 días y se usaron neuroesferas terciarias para los siguientes experimentos. Teniendo en cuenta la eficiencia de transfección calculada, ajustamos los valores de MOI (multiplicidad de infección) para NS/PC a 6,7 ​​(ESAL) y 2,7 ​​(hM3Dq) en función del título lentiviral por PCR cuantitativa (qPCR) y el número total de células por matraz, que fue constante a lo largo de los experimentos. La determinación del título se realizó mediante un ensayo de título lentiviral basado en qPCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Takara Bio, Shiga, Japón).

Las células alimentadoras de astrocitos de ratón, que se habían extraído de la corteza cerebral de ratón E17, se sembraron en portaobjetos de vidrio con cámara de 24 pocillos recubiertos con poli-D-lisina (Sigma-Aldrich). Las células alimentadoras se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % y aire al 95 % durante 3 a 7 días (5 × 104 células/pocillo). Las neuroesferas cuaternarias disociadas con TrypLE Select se sembraron en portaobjetos de vidrio de cámara recubiertos previamente con la capa alimentadora de astrocitos a una densidad de 1 × 105 células/pocillo. Las células se cultivaron durante 50 días en medio de maduración neuronal compuesto por Neurobasal Plus Medium (Thermo Fisher Scientific) complementado con B-27 Plus Supplement (Thermo Fisher Scientific), GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), Culture One Supplement (Thermo Fisher Scientific), y ácido L-ascórbico (200 μM) (Sigma-Aldrich). Para el ensayo de estimulación neuronal se añadió cloruro de potasio a una concentración de 50 mM y se mantuvo en el medio de cultivo durante 6 h. Para el ensayo de silenciamiento neuronal, se utilizó una mezcla de tres fármacos (butorfanol [Vetorphale], Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokio, Japón; clorhidrato de medetomidina [Domitor], Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd., Fukushima, Japón; midazolam , Sandoz KK, Tokio, Japón) en dos concentraciones: 12/3/10 μM (baja concentración) y 30/7,5/25 μM (alta concentración)61,62.

Ratones NOD-SCID hembra de ocho semanas de edad (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japón) se sometieron a SCI o cirugía simulada (el peso de los ratones SCI antes de SCI osciló entre 15,92 y 20,55 g). Para determinar el efecto terapéutico del trasplante en la función motora, se asignaron 30 animales al grupo de trasplante (TP) ESAL-NS/PC, al grupo de inyección de PBS (PBS) o al grupo de cirugía simulada (Sham) utilizando el método de lotería aleatoria (es decir, Se colocaron hojas de papel individuales con los números del 1 al 30 en una caja y se extrajeron piezas de papel al azar para cada grupo: grupo TP, n = 14; grupo PBS, n = 12; grupo simulado, n = 4). Al grupo TP se le inyectó un AAV en la semana 1 y se sometieron a mediciones luminiscentes longitudinales (el peso de los ratones TP y PBS varió de 15,07 a 19,69 g en la semana 0, de 15,00 a 20,75 g en la semana 3, de 16,26 a 22,86 g en la semana 6, y 17,14-22,43 g en la semana 9). Además, algunos ratones TP (n = 12) se sometieron preliminarmente a inyecciones de SCI, TP y AAV 6 semanas después de TP. Realizamos mediciones luminiscentes solo en la semana 10. Tanto ESAL como ratones trasplantados con NS/PC transducidos con hM3Dq (hM3Dq [+] TP, n = 5) se sometieron a mediciones de control positivo en la semana 6 (los datos estaban disponibles para n = 3). Por el contrario, otros ratones TP (hM3Dq [-] TP, n = 5) se sometieron a mediciones de control negativas en la semana 6 (los datos estaban disponibles para n = 4) y una evaluación de la influencia de la anestesia prolongada en los injertos en las semanas 6 y 9. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Keio y se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Institutos Nacionales de Salud, MD, EE. UU.).

Se anestesiaron ratones NOD-SCID hembra de ocho semanas de edad mediante inyecciones intraperitoneales de ketamina (60 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). No se administró analgesia adicional más allá de la ketamina. Bajo anestesia inhalatoria con isoflurano (1-2%) y O2, se eliminó el arco laminar de las vértebras a nivel de C4 y se expuso la superficie dorsal de la duramadre. Se insertó un cuchillo de alambre de tungsteno (McHugh Milieux, David Kopf Instruments, CA, EE. UU.) a 0,6 mm de la superficie dorsal y se elevó 0,5 mm para seccionar la columna dorsal31. Nueve días después de realizada la lesión, se trasplantaron al área lesionada 5 × 105 NS/PC por 2 μl a razón de 1 μl/min utilizando una aguja metálica con una jeringa Hamilton de 10 μl y un microinyector estereotáxico (KDS 310; Muromachi Kikai, Tokio, Japón) (ratones trasplantados con ESAL-NS/PC, total n = 31; ratones trasplantados con ESAL y NS/PC transducidos con hM3Dq, n = 5). La jeringa se dejó en el lugar de la inyección durante 2 minutos después de la inyección antes de retirarla. En cambio, se inyectó un volumen igual de PBS en ratones de control (ratones del grupo PBS, n = 12). Los ratones simulados se sometieron a laminectomía de la columna cervical C4 (ratones del grupo simulado, n = 4). La temperatura corporal se mantuvo a 37 °C colocando a los ratones en una placa de calentamiento digital. Administramos por vía intramuscular 12,5 mg/kg de ampicilina a los animales el día de la operación y el día posterior a la SCI. No realizamos cuidados intensivos después de una SCI porque los animales pudieron acceder a alimentos y agua por sí mismos a pesar de la influencia negativa en el movimiento de las extremidades anteriores. Los animales se mantuvieron durante un período de seguimiento de 10 semanas y luego se sacrificaron; el período fue de 6 semanas para ESAL y ratones trasplantados con NS/PC transducidos con hM3Dq (hM3Dq [+] TP; n = 3; dos animales murieron antes de las 6 semanas).

Para los experimentos de trasplante, el tratamiento con inhibidor de gamma secretasa (GSI) se aplicó el día anterior al trasplante como se describió anteriormente21. Brevemente, las NS/PC se cultivaron con un GSI de molécula pequeña, N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina t-butil éster (DAPT; Sigma–Aldrich, MO, EE. UU.) , disuelto en DMSO a una concentración final de 10 μM, durante un día antes del trasplante en el sitio de la lesión.

Los análisis a continuación se realizaron en las semanas 3, 6 y 9. El experimentador estaba cegado a los grupos de tratamiento en todo momento durante los experimentos de comportamiento.

La prueba de fuerza de agarre es una forma aceptada de evaluar la función de las extremidades anteriores. La recuperación de la función motora después del trasplante de células o la inyección de PBS se evaluó en función de la capacidad del animal para ejercer una fuerza de tracción63,64,65 (grupo TP; n = 13, grupo de inyección de PBS; n = 10 en el punto de tiempo final en semana 9). La prueba consistió en cinco tirones separados. Se excluyeron las fuerzas más alta y más baja, y se promediaron las tres fuerzas restantes66. Las medidas de fuerza también fueron divididas por el peso corporal67,68. La prueba de fuerza de agarre se realizó utilizando un dinamómetro digital (Shimpo, Kyoto, Japón) y un dispositivo de fijación de malla de alambre (Muromachi Kikai).

Para evaluar el deterioro de las extremidades anteriores, en particular la función CST, se utilizó la puntuación IBB del ratón siguiendo los métodos de la tarea de manipulación de alimentos de Irvine, Beatties y Bresnahan con ligeras modificaciones69,70,71. Brevemente, los ratones se aclimataron al entorno todos los días durante 10 días después de la SCI. Se administró cereal con forma de rosquilla y sabor a miel (Honey Nut Cheerios, MN, EE. UU.), y se registraron los movimientos de las extremidades anteriores con una cámara (GoPro, CA, EE. UU.) a 120 f/s dentro de la jaula de la casa (grupo TP, n = 13; grupo de inyección de PBS, n = 10; grupo simulado, n = 4 en el punto de tiempo final en la semana 9).

La tarea de caminar de la escalera horizontal (Conduct Science, MA, EE. UU.) midió la colocación de las patas en peldaños espaciados irregularmente72,73. Para evaluar la habilidad de caminar, se contaron los errores en cada cruce. Antes de SCI, entrenamos ratones usando un patrón regular de peldaños 20 minutos al día durante cinco días para habituarlos. Se colocó una cámara (GoPro) en un ligero ángulo ventral para registrar las cuatro extremidades a 60 f/s. El patrón de los peldaños espaciados irregularmente se modificó cada 3 semanas para evitar que los animales aprendieran el patrón y compensaran las deficiencias mediante el aprendizaje. El inicio se definió como el momento en que el ratón colocó las cuatro extremidades en los peldaños, y el final se definió como el momento en que el ratón alcanzó el último peldaño de la escalera. El primer paso después de la interrupción no se anotó.

Para investigar rigurosamente si la activación de CST alteró la actividad de los injertos neurales en la semana 10, se inyectó AAV2-hsyn-hM3Dq-mCherry (Addgene #50474-AAV2; 7.38 × 1012 vg/ml) en la corteza sensoriomotora bilateral en cuatro sitios (500 nL /punto; coordenadas = 1 mm rostral y 1,4 mm lateral al bregma, 1 mm posterior y 1 mm lateral al bregma; profundidad = 0,7 mm) a razón de 100 nL/minuto a través de una micropipeta de vidrio estirado (micropipeta calibrada, 1 –5 μL; Funakoshi, Tokio, Japón) en la semana 6 (ratones preliminares trasplantados con ESAL-NS/PC [n = 12]). Para investigar la asociación entre el movimiento de las extremidades superiores y la alteración de la actividad del injerto después de la activación de CST, se inyectó AAV2-hsyn-hM3Dq-mCherry en la corteza sensoriomotora bilateral en dos sitios (500 nL/punto; coordenadas = 1 mm rostral y 1,4 mm lateral). al bregma; profundidad = 0,7 mm) en la semana 1 (ratones trasplantados con ESAL-NS/PC para mediciones luminiscentes longitudinales [n = 14]). Se administró CNO (Enzo Life Sciences, NY, EE. UU.) por vía intraperitoneal a una concentración de 5 mg/kg. Para manipular la CST, un total de 26 ratones trasplantados con ESAL-NS/PC se sometieron a marcaje anterógrado de los axones de la CST con hM3Dq. Para incluirlos en los análisis de integración entre el CST del huésped y el injerto, los axones del CST tenían que cortarse y marcarse con éxito de acuerdo con la inmunohistoquímica, y el injerto tenía que detectarse claramente en la columna cervical mediante el conteo de fotones BLI (en las semanas 3, 6 , y 9). De los 12 animales preliminares, se excluyó un animal debido a su muerte antes de la medición final y un animal se excluyó debido a un etiquetado CST deficiente (n = 10 disponibles). De los 14 animales longitudinales, dos animales fueron excluidos debido a la muerte y dos animales fueron excluidos debido al etiquetado CST deficiente (n = 10 disponibles). La sección de CST se consideró exitosa para todos los demás ratones de acuerdo con los hallazgos inmunohistoquímicos74.

Las imágenes de bioluminiscencia se adquirieron utilizando el sistema IVIS Spectrum (Perkin Elmer, MA, EE. UU.). Para las neuronas cultivadas in vitro, la bioluminiscencia se midió inmediatamente después del tratamiento con AkaLumine-HCl 300 µM (FUJIFILM Wako Pure Chemical, Osaka, Japón). Se tomaron imágenes de los ratones trasplantados con NS/PC con infección doble en la semana 6. Se tomaron imágenes de los ratones trasplantados con ESAL-NS/PC en las semanas 6 y 9 o en las semanas 10-11 bajo anestesia por inhalación (2% de isoflurano y oxígeno) o bajo un mezcla de tres tipos de anestesia (butorfanol 5 mg/kg, clorhidrato de medetomidina 0,75 mg/kg y midazolam 4 mg/kg)75 durante 9 h, seguido de inhalación de isoflurano al 2% y oxígeno (las mediciones luminiscentes se evaluaron en la semana 3 , 6 y 9 sin 9 h de anestesia). En cada serie de experimentos, las mediciones se realizaron a la misma hora del día para todos los ratones. Para la activación de hM3Dq, en todos los animales, se inyectó solución de CNO 7 h antes de la medición. La señal se midió durante 15 min después de inyectar intraperitonealmente 50 μl de AkaLumine-HCl (60 mM) y solución salina. La región de interés (ROI) se fijó inmediatamente por encima de la médula cervical y se registró la intensidad máxima, observada aproximadamente a los 10 min en la mayoría de los casos. Los parámetros de medición fueron los siguientes: in vitro; tiempo de exposición = 1 s, binning = 8, campo de visión = 13,4 cm y f/stop = 1; en vivo; tiempo de exposición = 60 s, binning = 8, campo de visión = 23 cm y f/stop = 1. Todas las imágenes se procesaron con el software Living Image (IVIS Imaging Systems, versión 4.5.5), y la intensidad de la señal se expresa como el conteo de fotones en unidades de fotones/segundo/cm2/estereorradián. Cada resultado se muestra como una imagen de recuento de fotones pseudocoloreada superpuesta a una imagen anatómica en escala de grises.

Los tejidos del hipocampo aislados de embriones de ratón E17 se diseccionaron en trozos pequeños y se digirieron con 10 unidades/ml de papaína (Nacalai Tesque, Tokio, Japón) y 0,01 % de ADNasa I (Sigma-Aldrich) en PBS a 37 °C durante 15 min. Luego, las neuronas del hipocampo se cultivaron (3 × 105 células) en placas de 24 pocillos recubiertas con poli-L-lisina en medio Neurobasal Plus que contenía B27 Plus y GlutaMAX. Las células se infectaron con lentivirus-E-SARE-Venus-AkaLuc-PEST en DIV5, se silenciaron con TTX (1 µM, Tocris, Bristol, Reino Unido) en DIV7 y luego se estimularon con 4AP (250 µM, Tocris) y bicuculina (50 µM). , Sigma-Aldrich) en ausencia de TTX durante 10 min en DIV8 siguiendo los métodos de estudios previos13,76. Después de la estimulación, las neuronas se silenciaron nuevamente con un medio que contenía TTX 1 μM para suprimir la estimulación prolongada. En los puntos de tiempo designados (0, 2, 4, 6, 8, 10 y 24 h después de una estimulación breve), se adquirieron imágenes de bioluminiscencia utilizando el sistema IVIS Spectrum inmediatamente después del tratamiento con AkaLumine-HCl 300 µM.

El ARN total se extrajo con un kit RNeasy Micro (Qiagen, Inc., Hilden, Alemania) y el ADNc se sintetizó mediante transcripción inversa con ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo Co., Ltd., Departamento de Ciencias de la Vida, Osaka, Japón). ). La qPCR se realizó con un instrumento Step One Plus (Applied Biosystems, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresión de cada gen se normalizaron a los de ACTB utilizando el método comparativo ΔΔCT. Utilizamos los siguientes cebadores fabricados (Thermo Fisher Scientific) contra secuencias de ADN humano: FOS (Hs01119266_g1), ARC (Hs01045540_g1) y ACTB (Hs03023943_g1). Además, se utilizó EGFP (Mr00660654_cn) para detectar la expresión de Venus.

Las células cultivadas in vitro se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4 % durante 15 min. Todos los ratones fueron profundamente anestesiados y perfundidos transcardiacamente con PFA al 4% 10 semanas después de la lesión. El cerebro y la médula espinal se diseccionaron y se posfijaron en PFA al 4% durante 2 días. Luego, las médulas espinales fijadas se empaparon en sacarosa al 10 % en PBS 0,1 M durante la noche a 4 °C, seguido de sacarosa al 30 %. Las médulas espinales diseccionadas se incrustaron en un compuesto de temperatura de corte óptimo (Sakura Finetek, Tokio, Japón) y se seccionaron en el plano axial con un espesor de 12 μm en un criostato (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania). Las muestras se tiñeron con los siguientes anticuerpos primarios: anti-GFP (IgG de cabra, 1:500, Rockland, PA, EE. UU.), anti-mCherry (IgG de conejo, 1:400, Abcam, Cambridge, Reino Unido), antipanembrionario letal similar a la visión anormal (ELAVL) (IgG1 de ratón, 1:200, Sigma-Aldrich), anti-GFAP (IgG de conejo, 1:2000, Proteintech, IL, EE. UU.), anti-APC (IgG2b de ratón, 1:300, Abcam ), anti-GFAP humano (IgG1 de ratón, 1:2000, Takara Bio), anti-CNPasa (IgG1 de ratón, 1:2000, Sigma–Aldrich), anti-Ki-67 (IgG de conejo, 1:2000, Leica Biosystems) , anti-Nestina (IgG de conejo, 1;200, IBL, Gunma, Japón), anti-HNA (IgG1 de ratón, 1:100, Millipore, Darmstadt, Alemania), anti-Fos (IgG de conejo, 1:400, Abcam) , pan-ELAVL antihumano (IgG humana, 1:1000, un obsequio del Dr. Robert Darnell, The Rockefeller University, NY, EE. UU.), antisinaptofisina (IgM de ratón, 1:100, Millipore), anti-pan- AMPAR (conejillo de Indias, 1:500, Frontier Institute, Hokkaido, Japón) y anti-STEM121 (ratón IgG1, 1:200, Takara Bio). Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33258 (10 μg/ml, Sigma-Aldrich). Todas las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de fluorescencia (BZ-X710; Keyence, Osaka, Japón/THUNDER Imager Live Cell; Leica, Alemania) o un microscopio de barrido láser confocal (LSM 780; Carl Zeiss, Jena, Alemania).

Se realizaron análisis cuantitativos de las secciones de tejido después de la LME y el trasplante35. Los análisis tridimensionales del volumen de Venus+ (actividad del injerto)/volumen de HNA+ (células humanas) se realizaron como sigue. Se prepararon secciones axiales de ocho animales que se sometieron a trasplante de NS/PC transducido por ESAL y marcaje anterógrado en cuatro sitios (se sacrificaron 4 ratones 7 h después de la administración de CNO y se sacrificaron 4 ratones sin CNO), y el área Venus+ y el área HNA+ se determinado usando ImageJ. Luego se calculó el volumen mediante la siguiente ecuación:

donde A1 y A2 son las áreas de dos secciones consecutivas y h es la distancia entre ellas (480 μm).

La cuantificación de la sinapsis entre los axones CST y las neuronas injertadas se realizó en combinación con una macro personalizada utilizando ImageJ (ver. 2.1.0/1.53.c). Se contó el número de marcadores presinápticos (sinaptofisina) fusionados con terminales de axón CST marcados con mCherry integrados en el área STEM121+.

El procedimiento detallado utilizado para los análisis de microscopía inmunoelectrónica de preincrustación se ha descrito anteriormente77. Brevemente, las secciones congeladas de la médula espinal en portaobjetos de vidrio se descongelaron, secaron y esterilizaron en autoclave en tampón de ácido citrato (pH 6,0) antes del tratamiento de bloqueo (solución de Block Ace al 5,0 % [DS Pharma Biomedical, Osaka, Japón] con saponina al 0,01 % en PB 0,1 M) . Las muestras se tiñeron con los anticuerpos primarios anti-GFP (IgG de cabra, 1:100, Rockland) y anti-mCherry (IgG de conejo, 1:100, Abcam) y los anticuerpos secundarios antibiotina de conejo (IgG de burro, 1:800). , Jackson ImmunoResearch, Pensilvania, EE. UU.). Después del lavado con PBS, se aplicó Alexa Fluor 488: se aplicó el anticuerpo anti-IgG de cabra de conejo conjugado con FluoroNanogold™ (1:100, Nanoprobes, NY, EE. UU.) antes de la tinción con Hoechst 33258. Usamos los siguientes suplementos: complejo ABC (kit VECTASTAIN Elite ABC; Vector, CA, EE. UU.), TSA Plus biotina (NEL749A001KT; PerkinElmer, MA, EE. UU.), SA-Alexa Fluor 555 (1:1000, Thermo Fisher Scientific), SA-HRP (1:100, Vector) y 3,3 Comprimidos de ′-diaminobencidina (DAB) (FUJIFILM Wako Pure Chemical). Se prepararon secciones ultrafinas (80 nm de espesor) con un bisturí de diamante, se recolectaron en rejillas de malla de cobre (#100 o #150 Veco, Nisshin EM, Tokio, Japón) y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo en tubos de plástico durante 10 min. cada. Las secciones se examinaron con un microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEM-1400Plus, JEOL, Tokio, Japón) a 100 keV.

Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó una prueba t de Student de dos colas. Se utilizó un ANOVA de medidas repetidas para los análisis de los datos en la Fig. 2h y la Fig. 4a, c complementaria. Se utilizó ANOVA bidireccional de medidas repetidas para los análisis de los datos en la figura complementaria 2a-c. Para todos los análisis estadísticos, las diferencias se consideraron significativas a p < 0,05. Todos los datos se presentan como la media ± SEM. Para todos los cálculos se utilizó SPSS Statistics (Japan IBM, Tokyo, Japan. ver. 26). También se utilizó el software SAS (SAS Institute, NC, EE. UU., ver. 9.4) para ANOVA de medidas repetidas. Dado que este fue un estudio exploratorio, hicimos uso de un número modesto de muestras que pueden no haber sido adecuadas. El tamaño de muestra apropiado se calculó utilizando las calculadoras de herramientas estadísticas CRAB SWOG (https://stattools.crab.org). El criterio principal de valoración del estudio fue la alteración del recuento de fotones BLI del injerto desde la activación previa a la posterior a la CST a las 10 semanas después de la TP (Fig. 4l). Un análisis de poder post hoc realizado con el conjunto de datos en la Fig. 4l encontró que n = 11 ratones trasplantados fueron suficientes para alcanzar el criterio principal de valoración con un poder de 0,8 (un brazo normal). Se calculó la d de Cohen para medir el tamaño del efecto. Definimos el tamaño del efecto como grande si el valor d fue >0.878,79. Los tamaños de muestra del grupo PBS y el grupo simulado en la Fig. 2 complementaria se determinaron antes del estudio, con la prueba de fuerza de agarre utilizada como criterio principal de valoración. El análisis de potencia a priori reveló que n = 27 ratones en total eran suficientes con una potencia de 0,8 (normal de dos brazos). Los análisis IBB y de escalera horizontal se consideraron secundarios.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen se han incluido como Datos complementarios 1. Los datos restantes que respaldan los hallazgos están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Los autores agradecen a S. Yamanaka de CiRA (Universidad de Kyoto) por suministrar las iPSC humanas 414C2. Damos las gracias a K. Tanaka en el Departamento de Psiquiatría (Universidad de Keio) de orientación técnica y conceptual. Damos las gracias a HJ Okano y M. Hasegawa de la División de Medicina Regenerativa (Universidad Jikei) por su ayuda con los experimentos. Agradecemos a Y. Sato y K. Nagashima del Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública (Universidad de Keio) por su asesoramiento estadístico. Agradecemos la asistencia de H. Miyoshi, S. Nori, O. Tsuji, S. Ito, Y. Hoshino, Y. Tanimoto, T. Shibata, S. Hashimoto, Y. Suematsu, Y. Saijyo, T. Nishijima , T. Tanaka, K. Ito, L. Tao y K. Nakanishi, todos miembros del equipo de investigación de la médula espinal del Departamento de Cirugía Ortopédica y Fisiología (Universidad de Keio). También agradecemos a T. Harada, K. Yasutake y M. Akizawa por su ayuda con los experimentos y el cuidado de los animales. Este trabajo fue apoyado por la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) (subvención n.º JP20bm0204001, JP19bm0204001, JP20bk0104017 y JP19bk0104017 a HO y MN; subvención n.º JP20bm0704046 a SS y TS; subvención n.º JP18dm0207036 a HB), la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (beca KAKENHI número 22H03205 para NN; 17H06312 para HB), y la Asociación General de Seguros de Japón (Beca de Investigación Médica 2018 para KA)

Departamento de Cirugía Ortopédica, Facultad de Medicina de la Universidad de Keio, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokio, 160-8582, Japón

Kentaro Ago, Narihito Nagoshi, Takahiro Kitagawa, Momotaro Kawai, Keita Kajikawa, Reo Shibata, Yasuhiro Kamata, Kota Kojima, Morio Matsumoto y Masaya Nakamura

Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Keio, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokio, 160-8582, Japón

Kentaro Ago, Kent Imaizumi, Takahiro Kitagawa, Momotaro Kawai, Munehisa Shinozaki, Takahiro Kondo, Jun Kohyama y Hideyuki Okano

Laboratorio de función y dinámica celular, Brain Science Institute, RIKEN, 2-1 Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japón

Satoshi Iwano y Atsushi Miyawaki

Laboratorio de análisis molecular de funciones cerebrales superiores, Brain Science Institute, RIKEN, 2-1 Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japón

Masanari Otsuka

Departamento de Neuroquímica, Escuela de Graduados en Medicina, Universidad de Tokio, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokio, 113-0033, Japón

haruhiko bito

Sección de Desarrollo de Vectores Virales, Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas, 38 Nishigonaka Myodaiji, Okazaki, Aichi, 444-8585, Japón

Kenta Kobayashi

División de Anatomía Microscópica, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas y Dentales, Universidad de Niigata, 1-757 Asahimachi-dori, Chuo-ku, Niigata, Niigata, 951-8510, Japón

Shinsuke Shibata

Laboratorio de Microscopios Electrónicos, Facultad de Medicina de la Universidad de Keio, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokio, 160-8582, Japón

Shinsuke Shibata y Tomoko Shindo

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KA, NN, KI, T. Kondo, MS, SS, JK, MM, MN y HO diseñaron los experimentos. KA, T. Kitagawa, MK, K. Kajikawa, RS, YK, KK y TS realizaron los experimentos. SI, AM, MO, HB y K. Kobayashi prepararon los plásmidos o vectores virales. KA y todos los demás autores prepararon el manuscrito final.

Correspondencia a Narihito Nagoshi o Hideyuki Okano.

MN declara una función de consultoría con K-Pharma y financiación de investigación de RMic, Hisamitsu. HO declara una posición de liderazgo en la Facultad de Medicina de la Universidad de Keio y es consultor científico remunerado de San Bio Co., Ltd y K Pharma Inc. Todos los demás autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Ivo Lieberam, Anam Akhtar y Karli Montague-Cardoso.

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Reimpresiones y permisos

Ago, K., Nagoshi, N., Imaizumi, K. et al. Un sistema no invasivo para monitorear in vivo la actividad del injerto neural después de una lesión de la médula espinal. Commun Biol 5, 803 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03736-8

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Recibido: 12 Septiembre 2021

Aceptado: 18 julio 2022

Publicado: 10 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03736-8

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