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Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 6909 (2022) Citar este artículo

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La aparición de aislamientos de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina destaca la necesidad urgente de desarrollar más antibióticos. ClpP es una proteasa altamente conservada regulada por ATPasas en bacterias y mitocondrias. La activación aberrante de ClpP bacteriana es un método alternativo para descubrir antibióticos, mientras que sigue siendo difícil desarrollar activadores selectivos de ClpP de Staphylococcus aureus que puedan evitar alterar las funciones de ClpP de Homo sapiens. Aquí, utilizamos un diseño basado en la estructura para identificar (R)- y (S)-ZG197 como activadores ClpP de Staphylococcus aureus altamente selectivos. Los elementos estructurales clave en Homo sapiens ClpP, particularmente W146 y su acción conjunta con el motivo C-terminal, contribuyen significativamente a la discriminación de los activadores. Nuestros activadores selectivos muestran amplias propiedades antibióticas frente a una serie de cepas de estafilococos multirresistentes in vitro y demuestran una eficacia antibiótica prometedora en modelos de infección cutánea murina y de pez cebra. Nuestros hallazgos indican que los activadores específicos de especie de Staphylococcus aureus ClpP son agentes terapéuticos interesantes para tratar infecciones estafilocócicas.

Staphylococcus aureus (S. aureus) coloniza la piel humana y las fosas nasales y con frecuencia provoca enfermedades invasivas y potencialmente mortales1. El S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) es responsable de muchas infecciones intrahospitalarias, que incluyen infecciones del sitio quirúrgico, bacteriemia y sepsis2. MRSA ha adquirido resistencia a múltiples fármacos contra muchos antibióticos, incluidos β-lactámicos, cefalosporinas, fluoroquinolonas, aminoglucósidos, tetraciclinas, macrólidos y trimetoprim-sulfametoxazol3. Debido a esta resistencia, la profilaxis antibiótica de las infecciones por MRSA frecuentemente provoca enfermedades nosocomiales como la infección por Clostridium difficile4. Dada la disminución del suministro de antibióticos potentes, es cada vez más importante desarrollar nuevos métodos para tratar las infecciones por MRSA multirresistentes5. Con este fin, se necesita con urgencia el desarrollo de agentes antiestafilocócicos, en particular aquellos con un modo de acción diferente, para proporcionar futuros tratamientos para las infecciones por MRSA6,7,8,9,10,11.

La proteasa P caseinolítica (ClpP) es una proteasa altamente conservada regulada por ATPasas en bacterias y mitocondrias humanas, y desempeña un papel importante en el control de calidad de las proteínas al regular y degradar las proteínas mal plegadas o dañadas12,13. En bacterias, ClpP es responsable de modular la expresión de factores de virulencia, la resistencia a antibióticos y la formación de biopelículas y persistentes14,15,16,17. Asimismo, el Homo sapiens ClpP (HsClpP), que se encuentra en las mitocondrias, es una proteasa clave que regula la homeostasis de las proteínas mitocondriales. Estas proteínas están principalmente involucradas en los complejos de la cadena respiratoria18. La expresión desregulada o la distribución tisular de HsClpP está fuertemente asociada con enfermedades, como el cáncer y los trastornos neurológicos19,20.

Recientemente se ha demostrado que la disfunción de ClpP por activadores de moléculas pequeñas es un posible método para descubrir fármacos antibacterianos y anticancerígenos21. Sorprendentemente, los acildepsipéptidos (ADEP) se han identificado como una clase prometedora de antibióticos, lo que revela que la ClpP bacteriana es un posible objetivo de fármacos antibióticos22,23. Estos activadores naturales cambian alostéricamente S. aureus ClpP (SaClpP) a un estado de ganancia de función para degradar múltiples proteínas esenciales, como la Z filamentosa sensible a la temperatura (SaFtsZ), que inhibe la división celular y eventualmente conduce a la muerte de las células bacterianas24 ,25. Además, ADEP 4 suprime el crecimiento de persistentes y erradica una infección crónica de biopelícula cuando se combina con antibióticos comercializados23, lo que indica que la aplicación terapéutica de ADEP se puede utilizar en terapia combinada. Sin embargo, los problemas de inestabilidad química de los análogos de ADEP podrían restringir significativamente las aplicaciones del descubrimiento de fármacos antibióticos26. El descubrimiento de ADEP como activadores bacterianos de ClpP ha inspirado estudios sobre HsClpP. La activación aberrante de la actividad de la proteasa HsClpP degrada significativamente múltiples proteínas en el complejo de la cadena respiratoria, lo que ejerce efectos antitumorales27. Cabe destacar que se demostró que ADEP-28, un análogo de ADEP 4, activa HsClpP e induce efectos citotóxicos al activar la apoptosis intrínseca dependiente de caspasa28. Además, la imipridona ONC201 y ONC212 activan la proteasa HsClpP y facilitan la proteólisis mediada por ClpP, lo que provoca la letalidad de las células cancerosas27,29. ONC212 también funciona como un antibiótico, que activa ClpP de Escherichia coli, Bacillus subtilis y S. aureus en ensayos bioquímicos y genéticos y finalmente suprime la proliferación de células bacterianas30. Recientemente, descubrimos que ONC212 y ADEP 4 desregularon XooClpP para degradar XooFtsZ, lo que sugiere una estrategia prometedora para tratar las enfermedades del tizón de la hoja31. Otros activadores, como los análogos de bengamida y los activadores de proteasas autocompartimentalizadas (ACP), también muestran ciertas actividades en ClpP32,33,34. Sin embargo, hasta la fecha, no existe un activador específico de especie para la proteasa SaClpP.

En este estudio, informamos sobre dos activadores SaClpP altamente selectivos, (R)- y (S)-ZG197, que activan selectivamente SaClpP en lugar de HsClpP. Además, (R)-ZG197 exhibe una amplia gama de propiedades antibióticas frente a una variedad de cepas de MRSA y muestra una prometedora eficacia antibiótica in vivo.

Dado que ADEP 4 y ONC212 son activadores globales para las proteasas ClpP (Fig. 1a complementaria), nuestro objetivo es desarrollar activadores de moléculas pequeñas que mejoren selectivamente la actividad de la proteasa SaClpP sobre HsClpP (Fig. 1a). Dadas las relaciones estructura-actividad establecidas de ADEP 4 y ONC212 como activadores de ClpP29,35,36,37,38, buscamos distintos andamios químicos como activadores selectivos de SaClpP. Con este fin, llevamos a cabo un cribado de alto rendimiento (HTS) en una biblioteca de compuestos que contenía 3896 candidatos. Se confirmó que ICG-001 promueve la hidrólisis de la caseína marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC-caseína) en presencia de SaClpP (Figuras complementarias 1b y 1c). ICG-001 se caracterizó inicialmente como un inhibidor de la vía de señalización de Wnt, mientras que recientemente se evaluó como un activador de HsClpP39,40. Teniendo en cuenta el andamiaje distinto de ICG-001 y la síntesis practicable de derivados, elegimos ICG-001 como punto de partida para la optimización sintética de seguimiento41. La incorporación con el fragmento de isoleucina y el motivo 4,4,4-trifluorobutilo en el andamiaje central de ICG-001 proporcionó un potente activador ClpP ZG180 (Fig. 1b). ZG180 es más potente que ICG-001 en la activación de SaClpP para la hidrólisis de α-caseína, como lo demuestra una disminución de 3 veces en EC50 (Fig. 1c y Fig. 1d complementaria). Sin embargo, ZG180 también promueve HsClpP para la hidrólisis de α-caseína (Fig. 1c y Fig. 1e complementaria), lo que indica que ZG180 también es un activador global para las proteínas ClpP bacterianas y mitocondriales.

a El objetivo de este trabajo es desarrollar activadores selectivos de SaClpP. b El compuesto de plomo sintético ZG180 como activador ClpP. c Cuantificación de la hidrólisis de α-caseína por SaClpP y HsClpP en presencia de ICG-001 y ZG180, respectivamente (n = 3 experimentos biológicamente independientes). Los datos se presentan como media ± SD (barras de error). Estructura cristalina de rayos X de los complejos ZG180/SaClpP (d) y ZG180/HsClpP (e). Se muestran vistas laterales y superiores de los complejos estructurales. SaClpP se muestra en un tubo de dibujos animados gris, HsClpP se muestra en un tubo de dibujos animados de trigo y ZG180 se muestra en una esfera cian. f, g Los mapas de densidad de electrones y una vista cercana de la unión de ZG180 en los bolsillos hidrofóbicos de SaClpP (f) y HsClpP (g). El mapa de omisión de fo-fc tiene un contorno de 3,0 Å y está coloreado en verde, mientras que el mapa de 2fo-fc tiene un contorno de 1,0 Å y está coloreado en magenta. ZG180 se muestra en barra cian. Los enlaces de hidrógeno se indican con líneas discontinuas oscuras y se etiqueta la distancia en Å. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para investigar el mecanismo molecular de nuestra proteólisis de proteasas ClpP promovida por activador, resolvimos la estructura cristalina de ZG180 unida a SaClpP (7WID en PDB) y HsClpP (7WH5 en PDB) a una resolución de 1,90 Å y 2,13 Å, respectivamente (Supplementary Tabla 1). La estructura ZG180/SaClpP o ZG180/HsClpP es un único tetradecámero compuesto por dos anillos heptaméricos apilados (Fig. 1d, e). Al igual que los activadores de ClpP caracterizados previamente, la unión de catorce moléculas de ZG180 induce un estado abierto en los cilindros tetradecaméricos de ClpP con un poro de entrada de eje agrandado42,43,44,45. Las densidades de electrones aparentes en los mapas de omisión 2fo-fc y fo-fc demuestran inequívocamente la unión de ZG180 en la superficie apical de SaClpP y HsClpP (Fig. 1f, g). El motivo naftilo y la cadena trifluorobutilo en ZG180 forman un apilamiento hidrofóbico en los bolsillos de unión de SaClpP, lo que contribuye a las interacciones mejoradas. Una red de enlaces de hidrógeno entre ZG180 y las cadenas laterales de D27, L49, Q52, Y61 y Q89 aumentan colectivamente la afinidad de unión a SaClpP (Fig. 1f). Se observa una forma de unión similar en la estructura ZG180/HsClpP (Fig. 1g). Estas características estructurales son similares a los complejos estructurales informados anteriormente de SaClpP y HsClpP unidos con activadores de molécula pequeña, como ADEP 4/SaClpP, ADEP-28/HsClpP y ONC201/HsClpP27,28,35, en los que todas las moléculas activadoras están posicionados de manera similar en los bolsillos hidrofóbicos y evitan que la ATPasa se una a ClpP.

Para diseñar un activador específico para SaClpP sobre HsClpP, analizamos las secuencias de aminoácidos que pueden afectar el modo de unión de ZG180 en dos proteínas ClpP. Si bien SaClpP y HsClpP comparten una gran similitud en las secuencias primarias (Fig. 2a complementaria), hay un gran motivo de indol de W146 en HsClpP pero una cadena lateral de isopropilo mucho más pequeña de I91 en SaClpP en la posición conservada. De hecho, la superposición estructural de los complejos ZG180/SaClpP y ZG180/HsClpP también revela que es probable que el carbono α del motivo naftilo en ZG180 sea un sitio discriminante para introducir un choque estérico contra la cadena lateral voluminosa de W146 en HsClpP (Fig. 2a). Con este fin, incorporamos un grupo metilo en ZG180 para obtener dos análogos de naftalen-1-ilmetilo (R)- y (S)-ZG197 (Fig. 2b). Similar a ZG180, tanto (R)-ZG197 como (S)-ZG197 activan SaClpP para degradar α-caseína y SaFtsZ in vitro (Fig. 2c, Fig. 2b, c complementaria). A diferencia del activador ZG180 no selectivo, (R)-ZG197 activa SaClpP con un valor EC50 de 1,5 μM, que es una actividad 20 veces mayor que la que activa HsClpP, mientras que (S)-ZG197 no activa HsClpP incluso a 100 μM (Fig. 2c y Fig. 2d complementaria). Además, tanto (R)-ZG197 como (S)-ZG197 promueven la degradación de la proteína SaFtsZ celular en lisados ​​celulares de la cepa knockout (ΔclpP) de S. aureus 8325-4 clpP con el suplemento de la proteína SaClpP recombinante, pero no hay degradación de SaFtsZ. ocurrió en presencia de la proteína HsClpP recombinante. Por el contrario, el activador global ONC212 activa tanto SaClpP como HsClpP para degradar la proteína celular SaFtsZ (Fig. 2d). En conclusión, mediante el uso de un diseño basado en la estructura, desarrollamos con éxito los activadores SaClpP específicos de especie (R)- y (S)-ZG197 que alteran mínimamente la actividad de ClpP mitocondrial in vitro.

una superposición estructural de los complejos ZG180/SaClpP y ZG180/HsClpP para revelar la estrategia para diseñar activadores selectivos para SaClpP sobre HsClpP. SaClpP y HsClpP se muestran en tubos de dibujos animados grises y de trigo, respectivamente. ZG180 está coloreado en cian en la estructura ZG180/SaClpP, mientras que está coloreado en amarillo en la estructura ZG180/HsClpP. I91 en SaClpP y W146 en HsClpP se muestran como un palo. b Estructuras de los activadores SaClpP (R)- y (S)-ZG197 desarrollados por el diseño basado en la estructura descrito en (a). El grupo metilo quiral se indica en rojo. c Cuantificación de la hidrólisis de α-caseína por SaClpP y HsClpP en presencia de (R)- y (S)-ZG197, respectivamente (n = 3 experimentos biológicamente independientes). Los datos se presentan como media ± SD (barras de error). d Efecto de los activadores sobre la degradación de la proteína SaFtsZ celular con el suplemento de albúmina de suero bovino (BSA), el SaClpP recombinante y HsClpP, respectivamente, en lisados ​​celulares del mutante con deleción clpP (ΔclpP). La abundancia de SaFtsZ celular se cuantifica con un ensayo de transferencia Western. La cuantificación de la intensidad de la banda de SaFtsZ se normaliza frente al control de carga de SaGAPDH, y la relación en el grupo DMSO se considera 1,0. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para explicar por qué nuestros activadores activan selectivamente SaClpP en lugar de HsClpP in vitro, medimos las interacciones directas entre los compuestos (R)- o (S)-ZG197 y las dos proteasas ClpP. Durante el análisis de fluorimetría de barrido diferencial (DSF), (R)-ZG197 mejora significativamente la estabilidad térmica de SaClpP de una manera dependiente de la dosis mientras tiene un efecto débil sobre HsClpP (Fig. 3a). Esto indica que (R)-ZG197 exhibió una afinidad de unión más fuerte por SaClpP que por HsClpP. De manera similar, (S)-ZG197 aumenta la temperatura de fusión (Tm) de SaClpP pero apenas cambia la Tm de HsClpP (Fig. 3b). Luego realizamos un ensayo de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para determinar las estequiometrías de la capacidad de unión. La constante de disociación (Kd) para la unión de (R)- y (S)-ZG197 a SaClpP se estima cuantitativamente en 2,5 ± 0,2 μM y 5,0 ± 0,3 μM, respectivamente (Fig. 3c). También analizamos la unión de nuestros activadores a SaClpP y HsClpP en interferometría de biocapa (BLI). Del mismo modo, (R)- y (S)-ZG197 muestran una Kd de 58 ± 4,8 nM y 470 ± 60 nM para unirse a SaClpP, respectivamente (Fig. 3a complementaria). Sin embargo, ni (R)-ZG197 ni (S)-ZG197 exhiben una afinidad de unión detectable con HsClpP en el análisis BLI (Fig. 3b complementaria). Esto indica que nuestros activadores se unen selectivamente a SaClpP en lugar de a HsClpP in vitro.

Efecto de (R)- (a) y (S)-ZG197 (b) sobre la estabilidad térmica de SaClpP y HsClpP en el ensayo DSF, respectivamente. Tm, temperatura de fusión. c Determinación de la unión de (R)- y (S)-ZG197 a SaClpP mediante titulación ITC. Se indican la constante de disociación (Kd) y el factor estequiométrico (N). Efecto de los activadores sobre la estabilidad térmica de las células SaClpP (d) y HsClpP (e), respectivamente. El S. aureus 8325-4 se cultivó en presencia de un compuesto 10 μM durante 2 h antes de ejecutar CETSA (d), mientras que los lisados ​​​​celulares de HEK 293 T/17 se analizaron en CETSA (e). Las proteínas de las muestras no calentadas se utilizan como insumos y se consideran al 100 %. Los datos (a, b, d y e) se obtienen de tres experimentos biológicamente independientes y se presentan como media ± SD (barras de error). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, investigamos si nuestros activadores interactúan directamente con SaClpP en células estafilocócicas mediante la realización del ensayo de cambio térmico celular (CETSA). Observamos una estabilidad térmica significativamente mayor de SaClpP cuando la cepa S. aureus 8325-4 se cultivó con (R)- o (S)-ZG197 10 μM (Fig. 3d y Fig. 3c complementaria). Se produjo una elevación similar de SaClpP Tm cuando las células bacterianas se trataron con ONC212. Esto indica que nuestros activadores selectivos y el activador global ONC212 pueden unirse directamente a la proteasa SaClpP en las células estafilocócicas. También realizamos CETSA en la línea celular HEK 293T/17 para probar si nuestros activadores se unen a HsClpP. Similar al DMSO, (R)- y (S)-ZG197 tienen efectos mínimos sobre la estabilidad térmica de HsClpP en células HEK 293 T/17, mientras que ONC212 aumentó significativamente la estabilidad de HsClpP (Fig. 3e y Fig. 3d complementaria). Por lo tanto, los resultados del ensayo de unión celular resaltan las interacciones directas y selectivas de nuestros activadores hacia SaClpP pero no hacia HsClpP en contextos celulares, lo que es similar a los resultados de los ensayos de unión biofísica in vitro.

Para revelar la comprensión estructural del mecanismo de activación selectiva de (R)- y (S)-ZG197' en la proteólisis de SaClpP, determinamos las estructuras cristalinas de rayos X de (R)-ZG197/SaClpP (7XBZ en PDB) y (S )-ZG197/SaClpP (7WGS en PDB) complejos a una resolución de 2,15 Å y 2,11 Å, respectivamente (Tabla complementaria 1). Las estructuras resueltas demuestran que doce (R) -ZG197 o catorce (S) -ZG197 activadores se unen en los catorce bolsillos hidrofóbicos de SaClpP (Fig. 4a complementaria), y los mapas de densidad de electrones muestran claramente la existencia de (R) - y ( S)-ZG197, respectivamente (Fig. 4a, b). Los motivos naftilo de (R)- y (S)-ZG197 apuntan en diferentes direcciones debido a los sustituyentes metilo quirales. El grupo carbonilo en (R)- y (S)-ZG197 forma un enlace de hidrógeno con H83 de SaClpP, y la cadena lateral de Q52 también forma un enlace de hidrógeno con (R)-ZG197 directamente o (S)-ZG197 mediado por una molécula de agua. Los enlaces de hidrógeno adicionales mediados por las cadenas laterales de D27, L49 contribuyen conjuntamente a la unión de (S)-ZG197 a SaClpP (Fig. 4a, b). Además, se observan extensas interacciones hidrofóbicas en (R)- y (S)-ZG197 en los sitios de unión de ligandos de SaClpP (Fig. 4b complementaria). La alineación estructural de SaClpP (6TTY en PDB), ADEP 4/SaClpP (6TTZ en PDB), (R)-ZG197/SaClpP (7XBZ en PDB) y (S)-ZG197/SaClpP (7WGS en PDB) producen una raíz media de Cα baja valores de desviación cuadrada (RMSD) alrededor de 0.2 Å para el monómero ClpP, lo que indica una alta similitud del plegamiento de ClpP (Fig. 4c complementaria) 43,46,47. Al igual que el activador global ADEP 4, los enlaces (R)- y (S)-ZG197 inducen un estado extendido de SaClpP, que se ha caracterizado por una orientación recta de la hélice α526. Además, la tríada catalítica (S98, H123 y D172) también se muestra en orientaciones muy similares en estas estructuras (Fig. 4d complementaria). Curiosamente, solo cuatro o cinco de los catorce bucles N-terminales están ordenados en los complejos estructurales de (R)- y (S)-ZG197/SaClpP, lo que implica la naturaleza altamente dinámica de estos motivos tras la unión de activadores.

Vista cercana de las interacciones de (R)- (a) y (S)-ZG197 (b) en el sitio hidrofóbico de SaClpP. El mapa de omisión fo-fc para mostrar la unión (R)- y (S)-ZG197 está contorneado en 3,0 Å y coloreado en verde, mientras que el mapa 2fo-fc está contorneado en 1,0 Å y coloreado en magenta, respectivamente. (R)- y (S)-ZG197 están coloreados en rosa claro y azul claro, respectivamente. Los enlaces de hidrógeno se indican mediante líneas discontinuas oscuras y la distancia se indica en Å. c Vista cercana de las alineaciones estructurales de (R)- y (S)-ZG197 unidos a complejos SaClpP, y ZG180 unidos a HsClpP en los bolsillos hidrofóbicos. ZG180, (R)- y (S)-ZG197 están coloreados en cian, rosa claro y azul claro, respectivamente. SaClpP está coloreado en gris, mientras que HsClpP está coloreado en trigo. d Cuantificación de la hidrólisis de α-caseína por el mutante SaClpPI91W en presencia de (R)-ZG197, (S)-ZG197 y ONC212, respectivamente. e Efecto de los activadores sobre la estabilidad térmica de la proteína SaClpPI91W detectada en el ensayo DSF. f Imágenes de Western blot representativas que muestran los efectos de activadores 10 μM en la desnaturalización térmica de la proteína SaClpPI91W en células intactas de la cepa mutante clpPI91W complementada. Se indujo la expresión de SaClpPI91W en presencia de tetraciclina anhidra (ATC) a 1 ng/ml. Se realizaron tres réplicas biológicas para cada experimento. g Cuantificación de la hidrólisis de α-caseína promovida por activadores de ClpP por el mutante HsClpPW146A. h Efecto de los activadores sobre la estabilidad térmica del mutante HsClpPW146A detectado en el ensayo DSF. i La vista cercana de la alineación estructural en (c) muestra el efecto de los residuos C-terminales en la unión de los activadores y la activación de HsClpP. j Cuantificación del efecto de la hidrólisis de α-caseína activada por activadores por los truncamientos HsClpPΔC (izquierda) y HsClpPW146AΔC (derecha), respectivamente. k Efecto de los activadores en la estabilidad térmica de HsClpPΔC (izquierda) y HsClpPW146AΔC (derecha) detectados en el ensayo DSF Los datos (d, e, g, h, j y k) se obtienen de tres experimentos biológicamente independientes y se presentan como media ± SD (barras de error). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para comprender el mecanismo estructural que hace que (R)- y (S)-ZG197 se unan selectivamente y activen SaClpP pero no HsClpP, alineamos nuestras estructuras resueltas de (R)-ZG197/SaClpP y (S)-ZG197/SaClpP para la estructura ZG180/HsClpP. El grupo naftilo en (S)-ZG197 está posicionado en la dirección opuesta en comparación con ZG180 y (R)-ZG197, lo que da como resultado un choque directo con la cadena lateral de W146 en HsClpP. Esto puede restringir (S)-ZG197 para unirse a HsClpP en un modo similar a SaClpP (Fig. 4c). Mientras que el grupo naftilo en (R)-ZG197 está alejado de la cadena lateral de W146 en HsClpP, el sustituyente metilo en (R)-ZG197 puede generar un obstáculo espacial y chocar con W146 en HsClpP, lo que probablemente explica por qué (R )-ZG197 no puede interactuar con HsClpP. El análisis de alineación estructural sugiere que I91 en SaClpP y W146 en HsClpP son principalmente sitios críticos responsables de la unión selectiva y activación de nuestros activadores en SaClpP pero no en HsClpP.

Para ilustrar cómo I91 influye en la unión de nuestros activadores a SaClpP, construimos un mutante I91W en SaClpP para imitar el W146 correspondiente en HsClpP y determinamos si (R)- y (S)-ZG197 se unen y activan el mutante SaClpPI91W. Como se predijo, (S)-ZG197 exhibe una actividad significativamente disminuida en el mutante SaClpPI91W para la hidrólisis de α-caseína, mientras que (R)-ZG197 y ONC212 aún activan SaClpPI91W para degradar α-caseína in vitro (Fig. 4d y Fig. 4e complementaria). ). Luego investigamos las interacciones entre los activadores ClpP y el mutante SaClpPI91W en DSF. De acuerdo con la observación bioquímica, (S)-ZG197 no puede estabilizar térmicamente el mutante SaClpPI91W, mientras que (R)-ZG197 y ONC212 aún aumentan significativamente la Tm del mutante SaClpPI91W (Fig. 4e). Luego, determinamos cuantitativamente la afinidad de (R)-ZG197 para unirse a SaClpPI91W, y el Kd es 0.93 ± 0.2 μM en el ensayo ITC. No se observó unión entre (S) -ZG197 y SaClpPI91W (Fig. 4f complementaria). Cabe señalar que (R)-ZG197 sigue siendo positivo en el mutante SaClpPI91W. Esto se debe al sustituyente metilo en (R)-ZG197 que puede contribuir a la afinidad hidrofóbica con W91 en el mutante SaClpPI91W, mientras que probablemente choca con W146 en HsClpP (Fig. 4c). Una estructura resuelta del complejo (R)-ZG197/SaClpPI91W sería beneficiosa para revelar el mecanismo de este fenómeno. Además, construimos la cepa mutante clpPI91W complementada a través de un vector de expresión pYJ335 inducible por tetraciclina en el mutante ΔclpP (Fig. 4g complementaria), y evaluamos las interacciones celulares entre los activadores y el mutante SaClpPI91W en la cepa complementada. En línea con las interacciones observadas in vitro, el tratamiento con (S)-ZG197 no logra inducir el cambio de Tm de SaClpPI91W en células estafilocócicas intactas, mientras que (R)-ZG197 y el activador global ONC212 exhiben fuertes efectos en la estabilización de SaClpPI91W (Fig. 4f y Figura complementaria 4h).

También construimos el mutante HsClpPW146A para probar si el choque estérico propuesto entre nuestros activadores y la cadena lateral rígida de W146 restringe su unión a HsClpP. En contraste con la observación de que (R) -ZG197 está inactivo en HsClpP, (R) -ZG197 se vuelve activo para promover el mutante HsClpPW146A para la hidrólisis de α-caseína (Fig. 4g y Fig. 4i complementaria), y muestra afinidad de unión hacia HsClpPW146A según lo medido en el ensayo DSF (Fig. 4h). ONC212 siempre se une y activa tanto HsClpP como el mutante W146A in vitro. Sin embargo, dado que (S)-ZG197 no se une ni activa HsClpPW146A, planteamos la hipótesis de que otros factores estructurales atenúan la interacción de (S)-ZG197 y el mutante HsClpP. Previamente, se sugirió que el motivo adicional en el extremo C de HsClpP perturba la unión de la chaperona ClpX48. En particular, notamos que los residuos P248 y P249 podrían formar un motivo de tapa que podría dificultar el acercamiento y la unión de los activadores a los sitios hidrofóbicos de HsClpP (Fig. 4i). Este motivo de tapa adicional en HsClpP también se conserva en otros ClpP eucariotas, como Mus Musculus ClpP (MoClpP) y Danio Rerio ClpP (DaClpP). Sin embargo, esta secuencia C-terminal se acorta y el motivo de la tapa correspondiente está ausente en los ClpP bacterianos, como SaClpP y Escherichia coli ClpP (EcClpP) (Fig. 2a complementaria).

Luego purificamos las proteínas HsClpP truncadas C-terminal (HsClpPΔC) y HsClpPW146A (HsClpPW146AΔC) y detectamos los efectos de nuestros activadores en los dos truncamientos. Similar a los efectos débiles en HsClpPW146A, (S)-ZG197 aún activa mínimamente y apenas estabiliza HsClpPΔC in vitro (Fig. 4j y k y Fig. 4j complementaria). Sin embargo, (S) -ZG197 se vuelve activo para promover el mutante HsClpPW146AΔC para la hidrólisis de α-caseína y muestra una afinidad de unión medida en DSF (Fig. 4j y k y Fig. 4k complementaria), lo que indica la acción conjunta de W146 y motivo C-terminal en HsClpP. Curiosamente, tanto (R)-ZG197 como ONC212 exhiben capacidades mejoradas para unirse y activarse en HsClpPW146AΔC en comparación con HsClpPW146A y HsClpPΔC (Fig. 4j y k y Fig. 4k complementaria). En conjunto, esto indica que los dos aminoácidos distintos (I91 en SaClpP y W146 en HsClpP) en los bolsillos hidrofóbicos y el motivo de tapa C-terminal adicional en HsClpP son factores cruciales que pueden determinar la activación selectiva de SaClpP sobre HsClpP por parte de nuestra especie. activadores específicos.

A continuación, realizamos un ensayo de concentración inhibitoria mínima (MIC) en cultivo líquido para determinar los efectos antibacterianos de nuestros activadores en la cepa S. aureus 8325-4. (R)-ZG197 suprime significativamente S. aureus con una MIC cuantificada de 0,5 μg/mL, que es tan activa como ONC212 (Fig. 5a). (S)-ZG197 también inhibe el crecimiento de S. aureus 8325-4 y la MIC es de 4 μg/mL. Tanto (R)-ZG197 como (S)-ZG197 exhiben efectos inhibidores mucho mejores sobre el crecimiento de estafilococos que el compuesto exitoso ICG-001. Para analizar si la actividad antiestafilocócica de nuestros activadores depende de ClpP en S. aureus, determinamos los efectos inhibidores de nuestros activadores en el mutante ΔclpP y las cepas mutantes clpP o clpPI91W complementadas, respectivamente (Fig. 5a). Los activadores selectivos (R)- y (S)-ZG197 o los activadores globales ICG-001 y ONC212 suprimen mínimamente el crecimiento de la cepa mutante ΔclpP, y se observa que todas las CIM superan los 256 μg/mL. El fenotipo antibacteriano se puede rescatar en la cepa clpP complementada en presencia de activadores de ClpP. A diferencia de (R)-ZG197 e ICG-001 y ONC212, la actividad antibacteriana de (S)-ZG197 se atenúa significativamente en la cepa mutante clpPI91W complementada ya que (S)-ZG197 es inactivo en el mutante SaClpPI91W in vitro y en células. Esto indica que nuestros activadores exhibieron actividades antibacterianas de manera dependiente de SaClpP en S. aureus.

a Evaluación de los activadores de ClpP en el crecimiento de S. aureus 8325-4 con antecedentes genéticos de clpP, ΔclpP y clpP complementado o mutante I91W mediante medición de MIC. b Evaluación del efecto de los activadores de SaClpP sobre la abundancia de SaFtsZ celular en las células intactas de 8325-4, ΔclpP, las cepas clpP y clpPI91W complementadas detectadas en Western blot. La cuantificación de la intensidad de la banda de SaFtsZ se normaliza frente al control de carga de SaGAPDH, y la relación en el grupo DMSO se considera 1,0. c Vistas representativas de micrografías SEM que muestran los efectos de (R)- y (S)-ZG197 en la morfología celular de S. aureus 8325-4 con antecedentes genéticos diferentes de clpP, ΔclpP y clpP o clpPI91W complementados. La barra de escala representa 1 μm. d Vistas representativas de micrografías SEM que muestran el efecto de 20 µM (R)- y (S)-ZG197 en la división celular de las cepas Newman y USA300. La barra de escala representa 1 μm. e Determinación de la CIM de los activadores SaClpP frente al crecimiento de un panel de cepas de S. aureus. (R)- y (S)-ZG197, ONC212 y los antibióticos clínicos oxacilina, tetraciclina, eritromicina, norfloxacina, clindamicina y gentamicina se analizaron en condiciones similares. Los experimentos se realizaron por triplicado. f Efecto bactericida de la terapia combinada (R)- y (S)-ZG197 sobre la erradicación de la fase estacionaria USA300 (n = 3 experimentos biológicamente independientes). El número de células se registró en CFU/mL. Los datos se presentan como media ± SD. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La proteína de división celular SaFtsZ podría sobredegradarse tras la activación aberrante de SaClpP en presencia de activadores en las células25. De hecho, todos los activadores, incluidos (R)-ZG197, (S)-ZG197 y ONC212, disminuyen la abundancia de SaFtsZ en 8325-4 S. aureus pero no en la cepa mutante ΔclpP correspondiente, según lo detectado por el ensayo de inmunotransferencia (Fig. 5b). Las abundancias de SaFtsZ disminuyen drásticamente en el mutante clpP o clpPI91W complementado en presencia del activador selectivo (R)-ZG197 o el activador global ONC212. Similar a la observación de que (S)-ZG197 no podía activar la actividad de la proteasa mutante SaClpPI91W, no observamos una disminución obvia en la abundancia de SaFtsZ en la cepa clpPI91W complementada en presencia de (S)-ZG197. Esto indica que nuestros activadores indujeron la degradación aberrante de SaFtsZ en S. aureus, que depende en gran medida de la SaClpP celular.

La degradación desregulada de SaFtsZ podría afectar la división celular en S. aureus24,25. Luego medimos la morfología celular de las células estafilocócicas utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM), que podría reflejar los efectos inhibitorios de nuestros activadores sobre la división celular estafilocócica49. Los diámetros de las células estafilocócicas se miden como 0,64 μm, 0,69 μm, 0,73 μm y 0,75 μm en promedio para las cepas 8325-4, ΔclpP y clpP o clpPI91W complementadas en grupos de vehículos, respectivamente (Fig. 5c y Fig. 5a complementaria) . Curiosamente, similar a los efectos inhibidores del inhibidor de FtsZ TXA709 sobre la división celular estafilocócica, los tratamientos con (R)- y (S)-ZG197 aumentan significativamente los diámetros celulares de 8325-4 y las cepas clpP complementadas, con diámetros medidos generalmente mayores que 1,00 μm50. Se observó encogimiento, lisis y degradación total de la morfología de las células estafilocócicas en las bacterias tratadas con nuestros activadores. Por el contrario, no observamos cambios en el diámetro bacteriano o la morfología celular cuando el mutante ΔclpP se expuso a los activadores (R)- y (S)-ZG197. El tratamiento con (R)-ZG197 da como resultado un aumento del tamaño de las células en la cepa mutante clpPI91W complementada, mientras que (S)-ZG197 no tiene efecto sobre el diámetro bacteriano en esta cepa. También probamos el efecto de nuestros activadores selectivos en las divisiones celulares en Newman, un aislado clínico de la cepa S. aureus sensible a la meticilina, y en USA300, un aislado representativo de MRSA (Tabla complementaria 2). Se observó un fenómeno similar de diámetros ampliados en células Newman y USA300 en presencia de (R)- y (S)-ZG197 (Fig. 5d, Fig. 5b, c complementaria). Demostramos que (R)- y (S)-ZG197 exhiben efectos supresores sobre la división celular en S. aureus, que depende del SaClpP celular.

Dado que nuestros activadores específicos de especie suprimen el crecimiento de S. aureus 8325-4, luego probamos el espectro antiestafilocócico de (R)- y (S)-ZG197 contra un panel de cepas de S. aureus, incluida la cepa Newman y multidroga. cepas de SARM resistentes. Las cepas de MRSA USA300, NRS-1, NRS-70, NRS-100, NRS-108 y NRS-271 se recolectaron de la Red sobre resistencia a los antimicrobianos en S. aureus (Tabla complementaria 2). (R)-ZG197 muestra una fuerte actividad antibacteriana en un amplio espectro de estas cepas de S. aureus, con valores de MIC de 0.5-2 μg/mL, mientras que (S)-ZG197 suprime el crecimiento de estas cepas con valores moderados de MIC de 2– 8 μg/mL (Fig. 5e, panel izquierdo). También probamos los efectos antibacterianos de nuestros activadores en cinco aislamientos de MRSA resistentes a múltiples fármacos adquiridos en hospitales en China, incluidos XJ009, XJ036, XJ049, XJ051 y XJ052 (Tabla complementaria 2). Estos aislamientos clínicos de MRSA han desarrollado una resistencia notable a varios antibióticos clínicos, incluidos oxacilina, tetraciclina, eritromicina, norfloxacina, clindamicina y gentamicina, pero todos son sensibles a nuestros activadores con valores de CIM de 0,5-1 μg/mL para (R)- ZG197 y 2–8 μg/mL para (S)-ZG197, respectivamente (Fig. 5e, panel derecho). El activador global ONC212 también exhibe valores bajos de MIC en estas cepas.

Similar a ONC212 y vancomicina, tanto (R) -ZG197 como (S) -ZG197 exhiben excelentes efectos bactericidas en la cepa Newman de crecimiento exponencial (Fig. 5d complementaria). A continuación, evaluamos los efectos antibacterianos de nuestros activadores en la erradicación de los persistentes, que son células sometidas a un estrés agudo para despertar la persistencia de los antibióticos51. Una cohorte de células de S. aureus en fase estacionaria durante la noche que padecieron limitación de nutrientes son persistentes y fueron difíciles de erradicar con antibióticos convencionales52. Al igual que los ADEP del activador de ClpP bien establecidos, (R)-ZG197, (S)-ZG197, rifampicina y ciprofloxacina, cada uno por sí solo reduce mínimamente las unidades formadoras de colonias (UFC) de la cepa MRSA de los cultivos USA300 (Fig. 5f y Complementario). Fig. 5e), mientras que una terapia combinada que usa (R)-ZG197 o (S)-ZG197 con rifampicina o ciprofloxacina reduce significativamente el número de persistentes de USA300 hasta el límite de detección (Fig. 5f). Para investigar más a fondo el efecto supresor de la terapia combinada en las células persistentes de S. aureus, realizamos un ensayo de eliminación bifásica en la cepa USA300. De manera similar a ADEP 423, encontramos que agregar un segundo antibiótico convencional, como rifampicina o ciprofloxacina, afecta levemente el crecimiento de persistentes inducidos por ciprofloxacina, mientras que la presencia de activadores (R)- y (S)-ZG197 SaClpP erradican completamente los persistentes para el límite de detección (Fig. 5f complementaria). En conjunto, estos resultados verifican que nuestros activadores erradican la persistencia de estafilococos con la misma eficacia que ADEP 4 cuando se combinan con antibióticos convencionales.

También examinamos los mutantes resistentes de SaClpP inducidos por nuestros activadores específicos de especie. Las tasas de resistencia se definen de acuerdo con el protocolo establecido47. Las frecuencias de resistencia espontánea inducida por 4 × MIC de (R)-ZG197 y (S)-ZG197 están en el rango de 10−7, que son comparables con ADEP 4 y ONC212, los activadores globales de ClpP. Todos los sitios de mutación se distribuyen aleatoriamente y se ubican fuera de los bolsillos de unión hidrofóbicos de ClpP (Tabla complementaria 3).

Para probar los efectos antiinfecciosos de nuestros activadores in vivo, primero evaluamos sus perfiles bioactivos. A diferencia del compuesto exitoso de detección ICG-001 que se identificó inicialmente como un inhibidor de Wnt/β-catenina, (R)- y (S)-ZG197 interrumpen mínimamente la vía de señalización de Wnt/β-catenina en HEK 293T/17 y HK-2 líneas celulares en el ensayo indicador Wnt/β-catenina luciferasa (Fig. 6a complementaria)39. Luego investigamos los efectos de nuestros activadores SaClpP sobre la viabilidad de las líneas celulares HEK 293T/17 y HK-2 en el ensayo MTT. Como se anticipó, (R)- y (S)-ZG197 tienen efectos tóxicos mínimos sobre la proliferación de células de mamíferos, como lo demuestran las bajas actividades inhibidoras con valores altos de IC50 (Fig. 6b complementaria). Por el contrario, el activador global ONC212 y nuestro exitoso compuesto ICG-001 inhiben drásticamente la viabilidad de las células de mamíferos, especialmente ONC212, que tiene valores bajos de IC50 de 20 a 60 nM. También evaluamos el efecto citotóxico de nuestros activadores en el pez cebra. La administración de (R)- o (S)-ZG197 en una dosis única de 25 o 50 mg/kg no tiene ningún efecto citotóxico sobre la supervivencia del pez cebra (Fig. 6c complementaria). Cuando se administra a 100 mg/kg, ONC212 causa significativamente la muerte del pez cebra, mientras que (R)- o (S)-ZG197 sigue siendo seguro en el pez cebra (Fig. 6c complementaria). Esto indica la bioseguridad de nuestros activadores específicos de especie para infecciones antiestafilocócicas in vivo.

Luego evaluamos los efectos antibacterianos in vivo de ZG197 utilizando un modelo de infección de pez cebra, que es un modelo in vivo ampliamente utilizado para evaluar agentes antiestafilocócicos contra infecciones por S. aureus53. Primero determinamos las CFU apropiadas de S. aureus que pueden conducir a la mortalidad del pez cebra dentro de un período de tiempo razonable (Fig. 6d complementaria). Evaluamos la potencia antibacteriana de nuestros activadores SaClpP midiendo la tasa de supervivencia del pez cebra después de una infección estafilocócica durante cinco días (Fig. 6e complementaria). Una sola administración de 50 mg/kg de (R)- y (S)-ZG197 prolonga significativamente la tasa de supervivencia del pez cebra infectado con USA300 (Fig. 6a). Una dosis más baja de (R)- o (S)-ZG197 a 25 mg/kg también protege eficazmente al pez cebra contra la infección letal inducida por USA300 (Fig. 6f complementaria). De manera similar, la administración de 25 mg/kg o 50 mg/kg (R)-ZG197 mejora efectivamente la tasa de supervivencia del pez cebra infectado por Newman, que tiene una mejor tasa de supervivencia que ONC212 (Figura complementaria 6g y Figura 6b). Sin embargo, (R)-ZG197 pierde efectos terapéuticos en el pez cebra infectado con la cepa mutante ΔclpP, mientras que la vancomicina sigue siendo activa contra esta infección (Fig. 6c). Esto indica que el prometedor efecto antiestafilocócico de (R)-ZG197 en el pez cebra infectado depende de SaClpP in vivo. Una sola administración de 50 mg/kg de (R)-ZG197 produce un efecto terapéutico significativo en el pez cebra infectado con la cepa clínica MRSA XJ049. Por el contrario, esta cepa es resistente al tratamiento con antibióticos de uso clínico, oxacilina y eritromicina (Fig. 6d). No sorprende que el activador global ONC212 a 50 mg/kg no prolongue la tasa de supervivencia del pez cebra infectado con MRSA XJ049, probablemente debido a sus efectos secundarios citotóxicos al dirigirse a DaClpP (Fig. 6d).

a Efecto terapéutico de (R)- y (S)-ZG197 contra la infección USA300 en pez cebra. El pez cebra (n = 11 animales) se infectó con 7 × 106 CFU de USA300 y los compuestos se administraron en una dosis única de 50 mg/kg. Se administraron DMSO (5%) y vancomicina como controles. Efecto terapéutico de (R)-ZG197 contra la infección letal por Newman (b) y el mutante ΔclpP (c). El pez cebra (n = 11 animales) se infectó con 7 × 107 CFU de Newman (b) o 3 × 107 CFU del mutante ΔclpP (c), y los compuestos se administraron al pez cebra infectado a 50 mg/kg. Se usaron vancomicina y ONC212 como controles. d Efecto terapéutico de (R)-ZG197 en los aislados clínicos de MRSA infectados con peces cebra. El pez cebra (n = 11 animales) se infectó con 5 × 107 CFU de XJ049 y los compuestos se administraron en una dosis única de 50 mg/kg. Como controles se utilizaron DMSO (5%), antibióticos (vancomicina, eritromicina y oxacilina) y el activador global ONC212. e Cuantificación del tamaño de la lesión cutánea necrótica inicial (panel izquierdo) y 4 días después de la infección (panel derecho). Se utilizó vancomicina como control positivo. Los datos se muestran como media ± SD (n = 9 animales). f Imágenes representativas que muestran lesiones cutáneas necróticas 4 días después de la infección. La barra de escala representa 1 cm. g Efectos de nuestros activadores sobre los recuentos bacterianos en las muestras de piel (n = 8 muestras biológicamente independientes). El tejido de la piel se extirpó de ratones infectados con USA300 4 días después de la infección y se sembró en TSA para enumerar las UFC. h Micrografías de tejidos cutáneos teñidos con H&E después de los tratamientos indicados. La barra de escala representa 1 mm (superior) y 0,1 mm (inferior). Las diferencias estadísticas se analizaron mediante pruebas de rango logarítmico (a–d) y pruebas t de Student no pareadas de dos colas (e, g). Se proporcionan los valores P exactos. ns, sin importancia. Los datos (e, g) se presentan como media ± DE (barras de error). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Por último, evaluamos la eficacia antiinfecciosa in vivo de nuestros activadores en modelos de infección de piel murina por S. aureus54. La piel de los ratones se inoculó con 2,5 × 106 CFU de USA300 y apareció una lesión después de 16 h. Las áreas de lesión inicial en cada grupo son comparables (Fig. 6e). La inyección subcutánea de (R)- y (S)-ZG197 a 7,5 mg/kg dos veces al día provoca un tamaño de lesión necrótica más pequeño en ratones en comparación con el control del vehículo (Figs. 6e, f). Además, observamos una reducción significativa en la carga bacteriana cuando extirpamos las lesiones de los ratones tratados con (R)- y (S)-ZG197 en comparación con el control del vehículo (Fig. 6g). El análisis histológico con tinción de hematoxilina y eosina (H&E) también muestra una disminución en el área necrótica y los infiltrados inflamatorios en los tejidos de la piel cuando se trata con nuestros activadores o vancomicina, mientras que la muestra tratada con vehículo muestra densos infiltrados inflamatorios (Fig. 6h). En conjunto, identificamos a nuestros activadores como antibióticos prometedores contra las infecciones por MRSA multirresistentes in vivo pero con efectos citotóxicos mínimos.

La activación aberrante de la proteasa ClpP bacteriana es un método prometedor para el tratamiento de infecciones nosocomiales con bacterias Gram-positivas resistentes a los antibióticos. El activador de SaClpP deseado debería dirigirse preferentemente a la ClpP estafilocócica en lugar de alterar la función adecuada de la ClpP huésped. Sin embargo, trabajos anteriores identificaron varios activadores globales para las proteasas ClpP de múltiples especies, incluidos los análogos de ADEP y ONC212, que inevitablemente producirían efectos no deseados fuera del objetivo y dificultarían la aplicación en el descubrimiento de fármacos para la infección por anti-MRSA. Por lo tanto, la identificación de andamios químicos distintos que activan selectivamente SaClpP resaltará su potencial terapéutico antiinfeccioso para las infecciones por MRSA mediante una estrategia de quimioactivación.

Utilizamos HTS para compuestos que promueven la actividad de la proteasa ClpP y la validación experimental para identificar el compuesto peptidomimético disustituido con N-bencil y naftalen-1-ilmetilo (ICG-001) como un activador con una actividad moderada tanto para SaClpP como para HsClpP. La optimización sintética de los análogos de ICG-001 condujo al descubrimiento de (6S,9aS)-6-((S)-sec-butil)-8-(naftalen-1-ilmetil)-4,7-dioxo-N-(4, 4,4-trifluorobutil)hexahidro-2H-pirazino[1,2-a]pirimidina-1(6H)-carboxamida (ZG180) con actividades significativamente mejoradas en ambas proteasas. La incorporación del grupo sustituyente metilo en ZG180 hace que (R)- y (S)-ZG197 sean los activadores más potentes y altamente selectivos para SaClpP sobre HsClpP. Nuestros activadores aumentan la degradación aberrante de la proteína SaFtsZ en las células, inhiben la división de las células estafilocócicas y muestran una eficacia antibiótica significativa para prevenir el resultado letal de la bacteriemia por S. aureus in vivo. Trabajos anteriores demostraron que ICG-001 es un inhibidor de la vía de señalización de Wnt/β-catenina y ejerce efectos antiproliferativos en modelos murinos xenoinjertados. Sin embargo, nuestros activadores inhiben mínimamente la viabilidad de las líneas celulares de mamíferos, lo que debe explorarse más a fondo durante el desarrollo clínico de antibióticos.

Nuestra identificación de (R)- y (S)-ZG197 como activadores específicos de especie para SaClpP proporciona información estructural sobre el desarrollo de la unión selectiva y la quimioactivación específica de ciertos ClpP. El W146 voluminoso de HsClpP produce un choque estérico desfavorable con el sustituyente naftilo de impedimento en el activador (S)-ZG197, por lo tanto, evita la unión de los ligandos a HsClpP. Esto indica que el residuo W146/I91 es un factor crítico que determina parcialmente la selectividad de especies de nuestros activadores. Además de la observación de que W146 en HsClpP representa un punto crítico para la discriminación del activador, nuestro trabajo también revela la acción conjunta de W146 con el motivo C-terminal en HsClpP, como lo demuestran las actividades recuperadas de (S)-ZG197 y las actividades mejoradas de (R)-ZG197 hacia la unión y activación de HsClpPW146AΔC en comparación con el mutante HsClpPW146A o el truncamiento de HsClpPΔC. Junto con investigaciones publicadas anteriormente, esto muestra que los factores estructurales clave, incluida la diferencia espacial en los bolsillos hidrofóbicos y la coordinación de otros aminoácidos, contribuyen significativamente a la discriminación de los activadores de ClpP. Además, los activadores de variantes responden de manera diferente a las proteínas ClpP bacterianas y mitocondriales.

La quimioactivación de ClpP bacteriano lo cambia de manera eficiente a un estado incontrolable para desencadenar una degradación excesiva de numerosos sustratos que son cruciales para las bacterias y, en última instancia, destruir las bacterias patógenas. Demostramos que tanto (R)-ZG197 como (S)-ZG197 se unen selectivamente a SaClpP sobre HsClpP, inducen el SaClpP unido al activador en la conformación activa completamente extendida para la hidrólisis no selectiva de proteínas esenciales, como FtsZ. Aunque la ClpP bacteriana no es esencial para la supervivencia, los activadores de ClpP tienden a inducir la mutación de ClpP y, por lo tanto, desarrollan resistencia. Por lo tanto, la terapia combinada es probablemente el mejor método de aplicación terapéutica para los activadores de SaClpP, lo que podría reducir la resistencia basada en el objetivo, ampliar el espectro de antibióticos y reducir la dosis y los efectos secundarios no deseados. También mostramos que el uso de (R)-ZG197 o (S)-ZG197 en combinación con rifampicina o ciprofloxacina erradica drásticamente la población de persistentes hasta el nivel de detección.

Dadas las proteasas ClpP altamente conservadas entre múltiples especies, debe investigarse si nuestros activadores pueden cambiar de manera similar otras proteasas ClpP de diferentes especies a estados de ganancia de función, especialmente con bacterias Gram-negativas y microbiota intestinal. Se necesitan más optimizaciones sintéticas para mejorar las capacidades antimicrobianas de nuestros activadores SaClpP específicos de especie para tratar las infecciones por MRSA. La evaluación de los efectos antiinfecciosos de nuestros activadores en modelos infecciosos animales in vivo adicionales caracterizaría completamente la potencia antibacteriana de estos activadores.

En conclusión, informamos (R) - y (S) -ZG197 como activadores selectivos de SaClpP e identificamos los residuos / motivos críticos para promover selectivamente SaClpP en lugar de HsClpP. Nuestros datos brindan información mecanicista sobre la quimioactivación de las proteasas ClpP y aceleran el descubrimiento de antibióticos específicos de especie que pueden alterar selectivamente la función de la proteasa estafilocócica. Este trabajo tiene el potencial de inspirar estrategias prometedoras para el tratamiento de infecciones por MRSA y contribuye a la generación de andamios de antibióticos sintéticos potentes con una citotoxicidad mínima para el huésped.

El pez cebra de tipo salvaje (de 7 a 11 meses de edad, 300 ± 50 mg, independientemente del sexo) se compró en el acuario de Xiaoguan (Shanghai, China) y se mantuvo en un tanque de 10 L a temperatura ambiente con alimentación regular. Se utilizaron tamaños similares y distribución aleatoria de sexos del pez cebra para la infección por S. aureus. Se compraron ratones hembra BALB/c (de 6 a 8 semanas de edad, de 18 a 20 g) de Zhejiang Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Todos los ratones se mantuvieron con una dieta ad libitum en las instalaciones específicas libres de patógenos en Shanghai Public Centro Clínico de Salud. Se aplicaron a los ratones condiciones de alojamiento de ciclo de luz/oscuridad de 12 h, temperatura ambiente de 20 a 26 °C, humedad de 40 a 60 %.

Los anticuerpos de SaClpP (1:5000, Cat#C11185), SaFtsZ (1:5000, Cat#C11186) y SaGAPDH (1:5000, Cat#C1399) fueron generados por Shanghai Immune Biotech Ltd utilizando la proteína purificada como antígeno y validado por experimentos ELISA. Anticuerpos de HsClpP (1:2000, Clo#EPR7133, Cat#ab124822, Lot#GR3210822-8, Abcam), β-actina (1:5000, Clo#2D4H5, Cat#66009-1-Ig, Lot#10004156, Proteintech ), IgG anti-conejo de cabra conjugada con HRP (1:10,000, Cat#CW0103, Cwbio), e IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRP (1:10,000, Cat#CW0102, Cwbio) fueron adquiridas comercialmente.

Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio se proporcionan en la Tabla 2 complementaria. Dalian Meilun Biotech) y Mueller-Hinton Broth (MHB, Dalian Meilun Biotech) se utilizaron para el cultivo de S. aureus. Luria Bertani (LB) en caldo o medios de agar LB se utilizaron para el crecimiento de Escherichia coli (E. coli).

ZG180, (R)- y (S)-ZG197 se sintetizaron en laboratorio y se caracterizaron por completo. ONC212 y ADEP 4 se adquirieron de Topscience y ChemPartner (Shanghai, China), respectivamente. Los antibióticos de vancomicina, espectinomicina, eritromicina, ciprofloxacina, rifampicina, tetraciclina, norfloxacina, clindamicina y gentamicina se adquirieron de Dalian Meilun Biotech. La oxacilina se adquirió de Sigma-Aldrich. La tetraciclina anhidra (ATC) se adquirió de APExBIO.

Las líneas celulares HEK 293T/17 (CRL-11268) y HK-2 (CRL-2190) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Corning) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, GIBCO) y penicilina-estreptomicina al 1 % (Corning). Las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora con atmósfera humidificada que contenía CO2 al 5 % (Thermo Scientific). Todas las células han sido validadas mediante un perfil de repetición en tándem corto (STR) y se comprobó regularmente que no tenían micoplasma.

El plásmido pET28b-SaClpP se utilizó para la expresión de SaClpP49. Las cepas de E. coli BL21 (DE3) Gold se transformaron con el plásmido en presencia de 30 µg/mL de kanamicina. Cuando la DO600 (absorbancia a la longitud de onda de 600 nm) alcanza 0,6-0,8, se indujo la expresión de la proteína con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 mM a 30 °C durante 4 h. Luego, los sedimentos celulares se recolectaron y almacenaron a -80 °C. Las células se lisaron y el sobrenadante se sometió a una columna de 5 ml HisTrapTM HP (GE Healthcare) en tampón de unión (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM e imidazol 50 mM), y luego se eluyó con tampón de elución (tris-HCl 50 mM, pH 8,0). Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 100 mM e imidazol 400 mM). Las proteínas eluidas se concentraron con filtros ultracentrífugos Amicon con corte de 10 kDa (Merck-Millipore) y se sometieron a filtración en gel en un sistema de purificación AKTA con una columna HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare) en HEPES 20 mM, pH 7,0 y NaCl 100 mM. La mutación dirigida al sitio de SaClpPI91W se estableció de acuerdo con el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchang (Stratagene). Se aplicó un procedimiento similar en la purificación de SaClpPI91W.

El plásmido pET28a-SaFtsZ se utilizó para la expresión de SaFtsZ49 y se transformó en E. coli BL21 (DE3) Gold en presencia de 30 μg/mL de kanamicina. Cuando la DO600 alcanza 0,6, se indujo la expresión de SaFtsZ mediante IPTG 0,5 mM durante 12 ha 16 °C. Luego, los sedimentos celulares se lisaron y el sobrenadante se unió con 5 ml de columna HisTrapTM HP en tampón de unión (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM e imidazol 50 mM), y luego se eluyó con tampón de elución (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0). -HCl, pH 8,0, NaCl 200 mM e imidazol 400 mM). Las proteínas eluidas se concentraron con filtros ultracentrífugos Amicon con corte de 10 kDa (Merck-Millipore) y se almacenaron a -80 °C.

El plásmido pPSUMO-CLPPΔN56 se transformó en células de E. coli Rosetta (DE3) para la expresión de HsClpP40. Las células se cultivaron a 37 °C hasta que la DO600 alcanzó 0,6-0,8 y la expresión de HsClpP se indujo mediante IPTG 0,5 mM a 37 °C durante 4 h. Las células se lisaron en tampón de unión (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM y glicerol al 10%). Luego, el sobrenadante se pasó a través de una columna HisTrapTM HP de 5 ml. Después de lavar con tampón de unión, la proteína diana se eluyó con tampón de elución (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM y glicerol al 10%). A continuación, la proteína recogida se concentró y se resuspendió en tampón de unión. Luego, se agregó la proteasa ULP1 para escindir la etiqueta His-SUMO N-terminal a 4 °C durante la noche con agitación suave. Las fracciones restantes luego se pasaron a través de la columna HisTrapTM HP para eliminar la etiqueta His-SUMO y la ULP1 etiquetada con His. Se llevó a cabo una purificación adicional a través de una columna HiLoad 16/60 Superdex 200 en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM y glicerol al 5%. La construcción de plásmidos para HsClpPW146A, HsClpPΔC y HsClpPW146AΔC se realizó de acuerdo con el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchang. Las purificaciones de HsClpPW146A, HsClpPΔC y HsClpPW146AΔC fueron similares a las de HsClpP. Las proteínas se sembraron a -80 °C en glicerol al 30 %.

Las secuencias de los cebadores utilizados para construir plásmidos para mutantes se muestran a continuación:

SaclpPI91W-F: GATGTTCAAACATGGTGTATCGGTATGGC

SaclpPI91W-R: GCCATACCGATACACCATGTTTGAACATC

HsCLPPW146A-F: CCGATTTGTACCGCCTGTGTGGGTC

HsCLPPW146A-R: GACCCACACAGGGCGGTACAAATCGG

HsCLPPΔC-F: GTGCTGGTTCATTAGCCGCAGGATGGTGAAGATG

HsCLPPΔC-R: CATCTTCACCATCCTGCGGCTAATGAACCAGCAC

Se disolvieron diez microgramos de SaClpP, SaClpPI91W, HsClpP o HsClpPW146A en 50 μL de tampón que contenía HEPES-KOH 25 mM (pH 7,6), KCl 200 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10 % (v/v) y DTT, mientras que 10 μg de HsClpPΔC o HsClpPW146AΔC se disolvieron en 50 μL de tampón que contenía HEPES-KOH 25 mM (pH 7,6), MgCl2 5 mM, KCl 5 mM, Tween-20 al 0,03 %, glicerol al 10 % y DTT 2 mM. Se preincubaron varias concentraciones del compuesto (concentración final de DMSO al 1%) a temperatura ambiente durante 15 min. Luego se añadieron 0,72 mg/mL de α-caseína y la reacción se llevó a cabo a 37 °C durante 2 h. Las muestras se mezclaron con tampón de carga SDS y se analizaron mediante SDS-PAGE al 12% seguido de tinción con Coomassie Brilliant Blue R-250. Los valores de EC50 se calcularon con GraphPad Prism 8 a partir de tres réplicas biológicas.

La proteína SaClpP tetradecamérica (0,6 μM) en tampón PD (HEPES-KOH 25 mM (pH 7,6), KCl 200 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10 % (v/v) y DTT 2 mM) y compuestos (40 μM) en las placas negras de 384 pocillos de fondo plano. Después de incubar a 37 °C durante 30 min, se añadió sustrato FITC-caseína marcado con fluorescencia (0,048 mg/mL) (Sigma) y se inició la reacción de hidrólisis a 37 °C. Después de 2 h, las señales de fluorescencia se registraron a la longitud de onda de 485 nm para la excitación y 535 nm para la emisión utilizando un lector de microplacas (TECAN).

ZG180 y (R)- y (S)-ZG197 se sintetizaron en este laboratorio y los métodos sintéticos junto con las caracterizaciones se proporcionan en Métodos complementarios y la figura complementaria 7-23.

Las proteínas SaClpP y HsClpP se cristalizaron mediante el método de difusión de vapor de gota sentada a 16 °C. La muestra de 10 mg/ml de proteína se mezcló con una concentración de 5 veces del compuesto de ZG180, (R)- o (S)-ZG197 (que contiene DMSO al 5 %) y se incubó durante 30 min a 4 °C. Las gotas contenían 1 o 2 μL de muestra de SaClpP y 1 μL de solución de depósito de 2-metil-2,4-pentanodiol al 30 % (v/v), acetato de sodio 0,1 M/HCl (pH 8,0), cloruro de calcio 20 mM en presencia de de ZG180, o 1 μL de solución de reserva de 30 % v/v (+/-)-2-metil-2,4-pentanodiol, trihidrato de acetato de sodio 0,1 M (pH 4,6), cloruro de sodio 200 mM en presencia de (R )- y (S)-ZG197. La muestra de HsClpP a 10 mg/mL se incubó en presencia de ZG180 a una concentración de 5 veces en hielo durante 30 min y se mezcló con una solución de depósito de polietilenglicol 3350 al 20 % p/v, malonato de sodio 0,2 M (pH 5,0). Estos cristales crecieron después de una semana a más de un mes. Luego, los cristales se pescaron y empaparon en glicerol al 20% (v/v) durante 30 s, seguidos de almacenamiento en nitrógeno líquido.

Los datos de difracción de ZG180/SaClpP y (R)-ZG197/SaClpP se recopilaron a través de Bluice en la línea de luz BL19U155 de la instalación de radiación de sincrotrón de Shanghái (SSRF). Los datos de rayos X se procesaron a través del paquete de programas HKL2000. Los datos de difracción de ZG180/HsClpP o (S)-ZG197/SaClpP se recopilaron a través de Finback en la línea de luz SSRF BL02U1 y fueron procesados ​​automáticamente por Aquarium56. Las estructuras se resolvieron utilizando SaClpP (código PDB 3STA) y HsClpP (código PDB 1TG6) como modelo de búsqueda y los modelos se construyeron en COOT43,48,57. Finalmente, los datos fueron refinados con el programa REFMAC558. Los reflejos libres se seleccionaron y aplicaron automáticamente en todos los refinamientos. Las alineaciones de estructuras se realizaron en PyMOL59.

La degradación de SaFtsZ se analizó en SDS-PAGE in vitro. Brevemente, se disolvieron 10 μg de SaClpP en 50 μL de tampón PD. Después de agregar varias concentraciones de compuesto (concentración final de DMSO al 1%), la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. Luego se añadió SaFtsZ (1,5 μM) y la reacción se realizó a 37 °C durante 2 h. Las muestras se mezclaron con tampón de carga SDS y se analizaron mediante SDS-PAGE al 12% seguido de tinción con Coomassie Brilliant Blue R-250. Los valores de EC50 se calcularon con GraphPad Prism 8 a partir de tres réplicas biológicas.

El lisado celular de la cepa 8325-4/ΔclpP también se usó en el ensayo de degradación de SaFtsZ. Un cultivo de estafilococos durante la noche de 8325-4/ΔclpP se diluyó 1:500 y se cultivó hasta la fase exponencial temprana-media (OD600 = 0,4–0,6) a 37 °C. A continuación, se lavó el cultivo con tampón PD tres veces, seguido de lisis celular utilizando 0,75 U de lisostafina (Sigma). Luego, el lisado celular se centrifugó a 12 396 × g y el sobrenadante se recogió y se dividió en 50 μL. Se añadieron al sistema albúmina sérica bovina nueve micromolar (BSA, Dalian Meilun Biotech), proteína SaClpP o HsClpP y diversas concentraciones del compuesto. Después de una incubación a 37 °C durante 2 h, las muestras se mezclaron con tampón de carga SDS y se calentaron a 100 °C durante 10 min. Luego, las muestras se cargaron en SDS-PAGE para detectar la abundancia de SaFtsZ celular. Las proteínas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Millipore) y se bloquearon con TBST que contenía leche descremada al 5% a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de incubación con los anticuerpos primarios de SaFtsZ (1:5000) y SaGAPDH (1:5000) a 4° C durante la noche. Después de lavar con TBST, se añadió IgG anti-conejo de cabra marcada con HRP (1:10.000) para el análisis de transferencia Western.

La proteína SaClpP o SaClpPI91W se disolvió en HEPES 100 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM hasta una concentración final de 2 μM (concentración monomérica), mientras que HsClpP, HsClpPΔC, HsClpPW146A o HsClpPW146AΔC se disolvió en el tampón de ensayo que contenía Tris-HCl 20 mM. , pH 7,5, NaCl 500 mM y glicerol al 5% hasta una concentración final de 2 µM (concentración monomérica). Se añadieron compuestos en concentraciones variables (que contenían 1% de DMSO) al tampón de ensayo. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 min, se agregaron 5 × SYPRO Orange (Invitrogen) a cada muestra. La detección se registró en un CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) a la longitud de onda de 492 nm para excitación y 610 nm para emisión. Las muestras se calentaron de 25 °C a 95 °C a una velocidad de 1 °C/min. El análisis de datos se realizó con el software Bio-Rad CFX Manager y GraphPad Prism 8. La Tm de las proteínas en los grupos tratados con compuesto se comparó con la del grupo DMSO.

Los experimentos de ITC se realizaron en un tampón que contenía HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0, DMSO al 5 % a 25 °C y con agitación constante a 750 rpm en un sistema MicroCal iTC200 (GE Healthcare) según el método informado44,60. Las proteínas y los compuestos se disolvieron exactamente en el mismo tampón. La celda se llenó con (R)- o (S)- ZG197 50 μM, y la jeringa se llenó con SaClpPI91W a 500 μM o SaClpP a 700 μM. Después de un equilibrio automático del sistema, se inyectaron 2 μL de solución en una jeringa en la celda para desencadenar la reacción de unión y producir la secuencia máxima característica en la señal registrada. El análisis de datos, incluida la corrección y evaluación de la línea de base, se llevó a cabo con OriginPro 8.5 ITC. Se realizaron ajustes considerando todas las inyecciones excepto la primera para calcular el calor máximo y el valor de la constante de disociación de equilibrio (Kd).

Este experimento se realizó utilizando Octet RED96 (ForteBio). Las proteínas SaClpP y HsClpP se biotinilaron en tampón PBS a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, las proteínas biotiniladas se recolectaron utilizando una columna de desalinización PD MiniTrap™ G-25 (cytiva). Los biosensores de estreptavidina se incubaron en PBST (PBS con Tween-20 al 0,5 %) que contenía DMSO al 0,5 % durante 10 min, y luego se cargaron con 50 μg/ml de SaClpP o HsClpP biotinilados. El control de referencia aplicó un conjunto duplicado de sensores que se incubó solo en PBST con 0,5 % de DMSO. Se usaron varias concentraciones de (R)- y (S)-ZG197 para calcular la curva de unión. La detección se realizó con un protocolo estándar en placas negras de 96 pocillos con un volumen total de 200 μL a 30 °C. Los datos de BLI se recopilaron utilizando Octet Acquisition 11.0. Las señales se analizaron mediante un protocolo de sustracción de doble referencia para calcular la cinética de unión utilizando Octet Analysis 11.0. Los valores de Kd se calcularon a partir de la curva de ajuste estático constante.

Para construir el plásmido para la expresión constitutiva de SaClpP en S. aureus, se amplificó un fragmento de ADN, que cubre el gen clpP y sus 29 pares de bases cadena arriba, a partir de ADN genómico de S. aureus 8325-4 y se clonó en pYJ335. El mutante SaclpPI91W se construyó de acuerdo con el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II con los cebadores SaclpPI91W-F y SaclpPI91W-R. Para el mantenimiento del plásmido se utilizó ampicilina 100 μg/mL en E. coli y eritromicina 10 μg/mL en S. aureus. El plásmido se extrajo de DH5α y posteriormente se transformó en S. aureus RN4220 electrocompetente, del cual se volvió a extraer el plásmido y finalmente se transformó en células S. aureus 8325-4/ΔclpP electrocompetentes. Se utilizó eritromicina a 10 µg/ml para la selección de plásmidos y se añadió 1 ng/ml de ATC para inducir la expresión de proteínas.

Imprimación SaclpP-F1: GTAACAGTTATTACAAGGAGG

Cebador SaclpP-R1: AGGGGGCCCTTATTTTGTTTCAGG

Cebador SaclpPI91W-F: GATGTTCAAACATGGTGTATCGGTATGGC

Cebador SaclpPI91W-R: GCCATACCGATACACCATGTTTGAACATC

La sobreexpresión de la proteína se detectó usando Western blot. Se diluyó un cultivo de bacterias durante la noche a 1:1000 en TSB con aireación a 220 rpm. Cuando la DO600 alcanzó 0,6, se recogió 1 ml de cultivo y se centrifugó a 12 396 × g durante 3 min. Los sedimentos se lavaron con PBS tres veces y se resuspendieron en 100 μL de PBS con 0,75 U de Lysostaphin (Sigma) a 37 °C durante 30 min. A continuación, las muestras se centrifugaron a 12 396 × g, 4 °C durante 30 min y se recogieron los sobrenadantes. La concentración de proteínas se cuantificó con el kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime). Las muestras se diluyeron con tampón de carga SDS, se calentaron a 100 °C durante 10 min y se cargaron en SDS-PAGE para su análisis. Las proteínas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Millipore) y se bloquearon con TBST que contenía leche descremada al 5% a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de incubación con los anticuerpos primarios de SaClpP (1:5000) y SaGAPDH (1:5000) a 4° C durante la noche. A continuación, se añadió IgG anti-conejo de cabra marcada con HRP (1:10.000). La quimioluminiscencia mejorada (ECL) se utilizó para la autorradiografía y las imágenes se capturaron con GE ImageQuantLAS4000.

Las cepas de S. aureus 8325-4 con antecedentes genéticos de clpP, ΔclpP y el mutante clpP o I91W complementado se analizaron para determinar la degradación de SaFtsZ en células intactas. Se diluyó un cultivo durante la noche a 1:200 y se incubó con concentraciones variables de cada compuesto (0, 5, 10 y 20 μM, concentración final de DMSO al 1%). Cuando la DO600 alcanza 0,7, se añaden 300 μg/ml de espectinomicina y la reacción se lleva a cabo a 37 °C, 220 rpm durante 3 h. Luego se tomó 1 mL de cada muestra y se lavó tres veces con PBS. Las células se resuspendieron y lisaron con 0,75 U de lisostafina a 37 °C durante 30 min. El sobrenadante de los extractos de células lisadas se separó y la concentración de proteínas se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA seguido de análisis de transferencia Western. El análisis cuantitativo se realizó utilizando el software ImageJ. El grado de degradación de SaFtsZ se determinó midiendo la intensidad de banda de SaFtsZ frente a SaGAPDH y el panel de DMSO se consideró como 1,0.

Se recogieron colonias individuales de S. aureus 8325-4 y se cultivaron en TSA con agitación durante la noche. El cultivo se diluyó con 1:1000 y se hizo crecer hasta una DO600 = 0,6. Luego, el cultivo se resuspendió en PBS y se esparcieron 5 × 106 células en placas MHA que contenían (R)-ZG197, (S)-ZG197, ADEP 4 u ONC212 a 4 × MIC de cada compuesto. Después de 24 h, las colonias resistentes se eligieron al azar para las determinaciones y secuenciación de MIC. El gen SaclpP fue amplificado por PCR y secuenciado para determinar el sitio mutante.

Las secuencias de los cebadores utilizados para amplificar SaclpP se muestran a continuación:

Cebador SaclpP-F2: GTTATTACAAGGAGGAAAT

Cebador SaclpP-R2: CAGACAGCTTAGTCTACTC

Los cultivos nocturnos de cepas de S. aureus se diluyeron a 1:200 en medio TSB fresco y se incubaron con DMSO o (R)- y (S)-ZG197 20 μM y luego se agitaron a 37 °C, 220 rpm durante 3 h. Los cultivos se lavaron tres veces con PBS y se resuspendieron hasta una DO600 de 1,5. Luego se tomaron 50 μL de cultivos y se fijaron en cubreobjetos de 13 mm con 300 μL de glutaraldehído al 2,5 % (TED PELLA) en placa de 24 pocillos (Corning) a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, se eliminó el glutaraldehído de cada pocillo y se lavó tres veces con PBS. Luego, las muestras se tiñeron cuidadosamente con ácido ósmico durante 30 minutos y luego se lavaron tres veces con ddH2O. Las muestras se deshidrataron en una serie graduada de etanol (30, 50, 70, 80, 95, 100 %) durante 10 min con agitación suave en cada paso. Luego, las muestras se sometieron a un secado de punto crítico con CO2 líquido (Leica EM) para mantener la apariencia original de las muestras. Las muestras secas se recubrieron con una película de oro mediante recubrimiento por pulverización catódica (Leica EM). Se tomaron imágenes de las muestras en un FEI Quanta 250 a un voltaje de aceleración de 15 kV. Las imágenes se grabaron y el contraste y el brillo se ajustaron con Adobe Photoshop CS5.

Los cultivos nocturnos de S. aureus 8325-4 o las cepas SaclpPI91W rescatadas se diluyeron a 1:200 en TSB fresco y se incubaron con DMSO o compuestos 10 μM, incluidos (R)-ZG197, (S)-ZG197 y ONC212, para 2 horas Se recogió un mililitro de cada cultivo y se lavó con PBS tres veces. Luego, las muestras se resuspendieron en PBS que contenía inhibidores de cóctel (Sangon Biotech) y se dividieron en alícuotas de 50 μL y se calentaron a diferentes temperaturas durante 3 min usando un termociclador (BIO-RAD). A continuación, las bacterias se lisaron con 0,75 U de lisostafina a 37 °C durante 30 min, seguido de tres ciclos de congelación y descongelación con nitrógeno líquido para romper completamente las bacterias. Los lisados ​​solubles se recogieron por centrifugación a 12 396 × g durante 20 min a 4 °C y los sobrenadantes se analizaron mediante transferencia Western. Se utilizaron anticuerpos primarios de SaClpP (1:5000) y SaGAPDH (1:5000). Se realizaron tres experimentos independientes y se muestra uno de los resultados representativos.

Las células HEK 293 T/17 se digirieron con tripsina y se recogieron. Los sedimentos celulares se resuspendieron en PBS que contenía inhibidores combinados (Sangon Biotech) y se lisaron mediante tres ciclos de congelación y descongelación con nitrógeno líquido. Luego, las muestras lisadas se centrifugaron a 12 396 × g durante 30 minutos para eliminar los desechos. Después de la centrifugación, el sobrenadante se incubó con compuestos 10 μM, incluidos (R)-ZG197, (S)-ZG197 y ONC212, durante 20 minutos y luego se transfirió a los tubos de PCR de 0,2 ml y luego se desnaturalizó a las temperaturas indicadas durante 3 minutos. Luego, los sobrenadantes solubles se recogieron por centrifugación y se analizaron por Western blot. Se utilizaron anticuerpos primarios de HsClpP (1:2000) y β-actina (1:5000). Se realizaron tres experimentos independientes y se muestra uno de los resultados representativos.

Los cultivos se cultivaron en medio MHB a 37 °C con agitación a 220 rpm durante la noche hasta que la DO600 alcanzó 0,4-0,6 y luego se diluyó en medio MHB para dar una DO600 final de 0,025. Se añadieron compuestos a diversas concentraciones a cultivos bacterianos diluidos (100 µl/pocillo de volumen final y concentración final de DMSO del 1%) por triplicado. La concentración más baja de un antibiótico que inhibió el crecimiento visible de bacterias se registró después de la incubación a 37 °C durante 18 h. Los valores de MIC se determinaron mediante tres experimentos independientes.

Un cultivo de una noche de USA300 se diluyó en TSB con una OD600 final de 0,025 y se cultivó hasta la fase logarítmica media (OD600 de 0,6) a 37 °C, 220 rpm. Posteriormente, las células se diluyeron a 1 × 106 CFU/mL en TSB y se trataron con DMSO, vancomicina (20 μg/mL, 10 × MIC), (R)-ZG197 (5 μg/mL, 10 × MIC), (S) -ZG197 (80 μg/mL, 10 × MIC), o ONC212 (5 μg/mL, 10 × MIC). Después de 6 h de incubación a 37 °C, 220 rpm, se tomaron 200 μL de medio de cultivo y se lavaron con PBS tres veces. A continuación, se sembraron diluciones de cada condición en ausencia de compuestos y se cultivaron en placas TSA a 37 °C durante la noche. Las UFC se midieron contando el número de colonias al día siguiente.

Se realizaron dos ensayos para probar los efectos de (R)- y (S)-ZG197 en la erradicación de persistentes de MRSA. En primer lugar, se aplicaron células de S. aureus que crecían en fase estacionaria61. Después del cultivo durante la noche, se prepararon MRSA USA300 en fase estacionaria en caldo BHI y se incubaron en presencia de (R)-ZG197 (10 μg/mL), (S)-ZG197 (80 μg/mL), ciprofloxacina (8 μg/mL) , o rifampicina (0,4 μg/mL) a 37 °C y 220 rpm con aireación. En cada punto de tiempo indicado (0, 24, 48 y 72 h), se tomaron 100 μL de cultivo y se centrifugaron a 12 396 × g durante 2 min. Luego, la mezcla se lavó con PBS tres veces. Se realizaron diluciones en serie de 10 veces y se extrajeron 10 μl de cada dilución y se colocaron en placas TSA. Todas las placas se colocaron a 37 °C durante la noche. Las UFC se midieron contando el número de colonias al día siguiente.

El segundo ensayo de células persistentes se realizó utilizando el análisis de destrucción bifásico23. Durante la noche, el cultivo USA300 en fase estacionaria se diluyó a 1:100 en TSB. Las bacterias se incubaron primero con ciprofloxacina (8 μg/mL, 10 × MIC) durante 6 h a 37 °C con aireación a 220 rpm, y las células restantes formaron persistentes supervivientes. Luego compuestos a 10 × MIC, incluidos (R)-ZG197 (10 μg/mL), (S)-ZG197 (80 μg/mL), ADEP 4 (5 μg/mL), ciprofloxacina (8 μg/mL), o Se añadió rifampicina (0,4 μg/mL) y se tomaron muestras de 100 μL en el momento indicado (0, 2, 4, 6, 8, 12, 24 y 48 h) y se centrifugaron a 12 396 × g durante 2 min. Luego, las muestras se resuspendieron en PBS. Las UFC se midieron contando el número de colonias al día siguiente.

La toxicidad de los compuestos en las líneas celulares 293T/17 y HK-2 se realizó mediante el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Se sembraron células de mamífero (3000 células/pocillo) en placas de 96 pocillos que se dejaron adherir durante la noche y se trataron con una serie diluida de ICG-001, (S)-ZG197, (R)-ZG197 u ONC212 durante 72 h. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 10 μL de solución de MTT preparada (5 mg/mL en PBS) y luego las células se incubaron durante otras 4 h a 37 °C. Después de eliminar el sobrenadante, el precipitado de formazán de cada pocillo se disolvió en DMSO y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm mediante un lector de placas Tecan Spark de 10 m. Se usó DMSO como control y se consideró que su viabilidad era del 100%. Los valores de IC50 se calcularon ajustando las curvas de dosis-respuesta. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

La señalización de Wnt/β-catenina se detectó utilizando ensayos de reportero TOPFlash/FOPFlash como se describió anteriormente con modificaciones39. TOPFlash (nº 21-170, Millipore) se usó como indicador sensible a Wnt y FOPFlash (nº 21-169, Millipore) fue un indicador mutante no sensible a Wnt. Se sembraron aproximadamente 1,5 × 105 células HEK 293 T/17 o HK-2 en placas de 24 pocillos. Después de la unión, las células se transfectaron con 500 ng de reportero Firefly TOPFlash o FOPFlash usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mientras tanto, se cotransfectaron 50 ng del reportero Renilla pRL-TK (Promega) como control interno para corregir las diferencias en las eficiencias de transfección y recolección. Después de 6 h después de la transfección, el medio de cultivo se cambió a medio de crecimiento DMEM en presencia de LiCl 20 mM y compuestos en las concentraciones indicadas. Después de 24 h, las células se lisaron y detectaron mediante Dual-Luciferase Reporter Assay System (#E1910, Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de luciferasa de Firefly (TOPFlash o FOPFlash) se normalizó con la actividad de luciferasa de Renilla (pRL-TK). La actividad de señalización de Wnt se representó como valores TOPFlash/FOPFlash normalizados.

El pez cebra (7 a 11 meses de edad, 300 ± 50 mg, independientemente del sexo) se mantuvo en un tanque de 10 L con alimentación regular durante al menos tres días antes de someterlo a los experimentos. Los perfiles de seguridad se realizaron inyectando por vía intraperitoneal al pez cebra no infectado (n = 11 por grupo) con compuestos de 25, 50 o 100 mg/kg (disueltos en 5 % de DMSO, 20 % de PEG 300, 5 % de solutol y 70 % de PBS) . Para la determinación de una carga estafilocócica adecuada para la infección, se administró pez cebra con UFC en serie de bacterias y se controlaron las tasas de supervivencia durante 5 días. A un grupo de peces cebra se le inyectó por vía intraperitoneal el mismo volumen de PBS (8 μL) que el control en blanco.

Para investigar la eficacia antiinfecciosa de los compuestos, se inyectaron por vía intraperitoneal cepas de S. aureus (USA300, Newman, Newman ΔclpP o MRSA XJ049) al pez cebra en las CFU indicadas. Después de 30 minutos después de la infección, el pez cebra se dividió aleatoriamente en diferentes grupos, seguido de la administración de compuestos a una dosis de 25 o 50 mg/kg y el vehículo de control. Se registraron las tasas de supervivencia del pez cebra durante 5 días.

El modelo de infección se estableció según el método previamente informado con algunas modificaciones62. Se afeitó el lomo de ratones (6 a 8 semanas de edad, 18-20 g) y se trató con crema depilatoria un día antes de la infección. Los cultivos de la noche a la mañana de S. aureus USA300 se diluyeron a 1:1000 y se desarrollaron hasta una DO600 a 0,6. Luego, los cultivos se lavaron con PBS tres veces y se resuspendieron a una concentración de 5 × 107 UFC/mL. Antes de la infección, los ratones se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de 70 mg/kg de pentobarbital sódico. Se inyectó por vía subcutánea una alícuota de 50 µl de suspensión de S. aureus USA300 (que contenía 2,5 × 106 CFU) en el área afeitada. A las 16 horas posteriores a la infección, los ratones se dividieron aleatoriamente en diferentes grupos (n = 9 por grupo). El área de la lesión se midió y calculó utilizando la fórmula A = π(L/2) × W/2 (A, área; L, largo; W, ancho). La diferencia de las áreas de lesión inicial no tiene significación en cada grupo. A continuación, se inyectaron subcutáneamente cerca de la piel infectada 50 µl de compuestos de 7,5 mg/kg (disueltos en DMSO al 5 %, PEG 300 al 20 %, solutol al 5 % y PBS al 70 %) y vehículo (como control negativo). Los tratamientos se aplicaron dos veces al día durante 3 días. A continuación, se sacrificaron los ratones y se separó la piel de la fascia subyacente y del tejido muscular. Una de las nueve muestras de piel de cada grupo se usó al azar y se fijó en paraformaldehído al 4 % y se incrustó en parafina. Se cortaron secciones delgadas y se tiñeron con H&E para observaciones microscópicas. Las ocho muestras de piel infectadas restantes en cada grupo se extirparon asépticamente y se pesaron, y posteriormente se homogeneizaron en 1 ml de PBS. El homogeneizado diluido en serie se sembró en placas TSA y se incubó a 37 °C durante la noche. Los recuentos bacterianos se expresaron como log10 UFC/mg de tejido.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 8 (software GraphPad). Se realizaron pruebas de rango logarítmico para comparar las dos curvas de supervivencia. Se realizaron pruebas t de Student no apareadas de dos colas para comparar las medias entre grupos. Los datos se presentan como media ± SD. Los valores de P se indican en las figuras. El número de experimentos/ratones/muestras independientes se menciona en las leyendas de las figuras. Todos los intentos de replicación son exitosos. Todas las transferencias y geles se realizaron por triplicado y se muestra una sola imagen experimental. Los experimentos de infección de piel murina, SEM y tinción con H&E se realizaron una vez. Se registraron al menos 5 imágenes representativas de SEM de cada muestra. Se tomaron tres imágenes representativas de tinción H&E en cada muestra y se muestra una. Todas las imágenes registradas en SEM o tinción H&E indicaron una tendencia similar.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de coordenadas atómicas y factores de estructura generados en este estudio se han depositado en Protein Data Bank (PDB, www.pdb.org) con el código de acceso 7WH5 para ZG180/HsClpP, 7WID para ZG180/SaClpP, 7XBZ para (R)-ZG197 /SaClpP y 7WGS para la estructura (S)-ZG197/SaClpP, respectivamente. Otros datos estructurales de rayos X utilizados en este estudio están disponibles en la base de datos PDB con el código de acceso 6TTY, 6TTZ, 3STA y 1TG6. La secuencia de aminoácidos se puede encontrar en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) con el número de acceso NP_006003 para HsClpP, CAA06443 para MoClpP, NP_001018520 para DaClpP, KFL07692 para SaClpP y CAD6014684 para EcClpP. Todos los datos relevantes generados en este estudio se proporcionan en el archivo de información complementaria y datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento. Los datos están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a la Dra. Hanne Ingmer (The Royal Veterinary and Agricultural University, Dinamarca) por el obsequio de S. aureus NCTC 8325-4 y 8325-4/ΔclpP y al Dr. Jiahai Zhou (Instituto de Química Orgánica de Shanghai, China) por el regalo del vector pPSUMO. Agradecemos al personal de la línea de luz BL19U1 y BL02U1 en la instalación de radiación de sincrotrón de Shanghái por su apoyo en la recopilación de datos. Agradecemos al personal del Departamento de Modelos de Animales de Laboratorio, Centro Clínico de Salud Pública de Shanghai, Universidad de Fudan por el apoyo de las instalaciones. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (22037007, 81861138046 y 21725801 a C.-GY y 22107109 a TZ).

Estos autores contribuyeron por igual: Bingyan Wei, Tao Zhang, Pengyu Wang.

Escuela de Ciencia y Tecnología Farmacéutica, Instituto de Estudios Avanzados de Hangzhou, Academia de Ciencias de la Universidad de China, Hangzhou, 310024, China

Bingyan Wei, Pengyu Wang, Yihui Pan, Lefu Lan y Cai-Guang Yang

State Key Laboratory of Drug Research, Centro de Biología Química, Instituto de Materia Médica de Shanghái, Academia de Ciencias de China, Shanghái, 201203, China

Bingyan Wei, Tao Zhang, Pengyu Wang, Yihui Pan, Jiahui Li, Lefu Lan y Cai-Guang Yang

Universidad de la Academia China de Ciencias, Beijing, 100049, China

Bingyan Wei, Pengyu Wang, Yihui Pan, Jiahui Li, Lefu Lan y Cai-Guang Yang

Escuela de Ciencias Físicas y Tecnología, Universidad ShanghaiTech, Shanghái, 201210, China

Weizhong Chen y Quanjiang Ji

Departamento de Medicina de Laboratorio, Shanghai East Hospital, Facultad de Medicina de la Universidad de Tongji, Shanghai, 200123, China

Min Zhang y Wenjuan Wu

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Fudan, Shanghái, 200433, China

Jianhua Gan

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C.-GY concibió el proyecto y supervisó la investigación. BW realizó una investigación con la ayuda de TZ, PW, YP, JL, WC y MZ; activadores sintetizados de TZ; QJ, WW, LL, JG y C.-GY contribuyeron con agentes y análisis de datos; BW, TZ, PW y C.-GY escribieron el manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Cai-Guang Yang.

BW, TZ, PW y C.-GY son los inventores de la solicitud de patente pendiente (CN202210377247.X, para la Oficina de Patentes de China) relacionada con el trabajo descrito. El solicitante de la patente es el Instituto de Materia Médica de Shanghai, Academia de Ciencias de China. El estado de la solicitud es presentación oficial. Las estructuras de ZG180, (R)- y (S)-ZG197 están cubiertas por la solicitud de patente. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Los protocolos de los experimentos de infección de la piel murina fueron revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Clínico de Salud Pública de Shanghai. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y normas éticas pertinentes. La licencia de uso de animales de laboratorio (SYXK-HU-2015-0027) está certificada por el Comité de Ciencia y Tecnología de Shanghai.

Nature Communications agradece a Youfu Luo, Dacheng Wang, Maria Bewley y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Wei, B., Zhang, T., Wang, P. et al. Terapia antiinfecciosa utilizando activadores específicos de especie de Staphylococcus aureus ClpP. Nat Comun 13, 6909 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34753-0

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Recibido: 12 Abril 2022

Aceptado: 07 noviembre 2022

Publicado: 14 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34753-0

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