Encapsulación directa de biomoléculas en semi | Shijiazhuang Agile Peak Ventures Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21391 (2022) Citar este artículo

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La compartimentación puede servir para diferentes propósitos, como la protección de sustancias activas biológicas del medio ambiente o la creación de una combinación única de biomoléculas para aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas u otras aplicaciones de bioingeniería. Presentamos un método para la encapsulación directa de moléculas en microcápsulas biocompatibles y semipermeables hechas de diacrilato de poli(etilenglicol) de bajo peso molecular (PEG-DA 258). Las microcápsulas se producen utilizando un chip microfluídico PDMS no plano que permite la producción en un solo paso de emulsiones dobles de agua en PEG-DA 258 en agua, que se polimerizan con luz ultravioleta en una cubierta de poli-PEG-DA 258. Las microcápsulas semipermeables se obtienen agregando un solvente inerte al PEG-DA 258. Debido a la hidrofilia favorable del poli-PEG-DA 258, las proteínas no se adsorben en la cubierta de la cápsula y demostramos la encapsulación directa de las enzimas, que también se puede secar en las cápsulas para conservar la actividad. Finalmente, aprovechamos la permeabilidad de la cápsula para la implementación de una cascada de comunicación de dos capas utilizando reacciones de desplazamiento de hebras de ADN compartimentadas. Este trabajo presenta la encapsulación directa de biomoléculas activas en microcápsulas semipermeables, y esperamos que nuestra plataforma facilite el desarrollo de células artificiales y la generación de diagnósticos o terapéuticos encapsulados.

Los avances recientes en microfluídica, ciencia de materiales, biología sintética y bioingeniería permiten la ingeniería de precisión de compartimentos de tamaño micrométrico, lo que permite la manipulación de sistemas biomoleculares cada vez más complejos1,2. La tecnología de microfluidos de gotas permite la producción de compartimentos poliméricos con un tamaño y una estructura definidos con precisión, moldeados a partir de emulsiones dobles o emulsiones de orden superior con una fase polimerizable, según lo revisado por Datta et al.3. Un inconveniente de los precursores poliméricos utilizados como fase intermedia es que los compartimentos polimerizados obtenidos son, en general, herméticos a la permeación de los solutos; sin embargo, Kim et al.4 demostraron que se pueden fabricar cubiertas poliméricas semipermeables introduciendo un diluyente inerte, o porógeno, en la fase precursora del polímero. Tras la polimerización UV, el porógeno no reactivo se excluye del polímero polimerizante en un proceso llamado separación de fases inducida por polimerización (PIPS). Sin embargo, el inconveniente de los polímeros utilizados en este estudio y de la mayoría de los polímeros obtenidos a partir de precursores inmiscibles en agua es la hidrofobicidad de la cubierta de la cápsula polimerizada que conduce a la adsorción de proteínas y, por lo tanto, impide la encapsulación directa de proteínas o enzimas.

Recientemente se demostró que el PEG-diacrilato con un peso molecular de 258 g/mol PEG-DA 258 se puede utilizar como fase intermedia polimerizable para la producción de emulsiones dobles con un dispositivo capilar microfluídico5. Los investigadores también demostraron que el poli-PEG-DA 258 tiene una hidrofilicidad similar a la de los hidrogeles hechos de derivados de PEG-DA solubles en agua de mayor peso molecular. Tales características favorables les permitieron encapsular directamente el fibrinógeno sin una adsorción notable en la cubierta del polímero. Sin embargo, las cápsulas producidas también eran herméticas e impedían incluso que los colorantes de molécula pequeña (sal disódica de eriglaucina: 793 g/mol, aceite rojo O: 408 g/mol) se difundieran fuera de las cápsulas, lo que limitaría severamente el uso y el rango de aplicación de este tipo de cápsulas.

Para encapsular directamente macromoléculas biológicamente activas en cápsulas semipermeables biocompatibles, combinamos las características favorables del PEG-DA 258 de bajo peso molecular con la formación de poros mediante PIPS. En este estudio, utilizamos un dispositivo de microfluidos PDMS con una geometría no plana, coaxial y de enfoque de flujo que no requiere tratamiento superficial para producir emulsiones dobles de agua en PEG-DA 258 en agua. Para obtener cápsulas semipermeables, utilizamos PIPS para formar pequeños poros en las cubiertas de las cápsulas. Al encapsular cargas fluorescentes de diferentes tamaños o colocar cápsulas vacías en soluciones que contenían fluororóforos, demostramos que las cápsulas eran semipermeables con un límite de tamaño que permitía la encapsulación directa de proteínas y enzimas de 32,7 kDa y más, al tiempo que permitía el transporte de moléculas más pequeñas. Las biomoléculas se retuvieron en las cápsulas sin degradación y se distribuyeron homogéneamente dentro de las cápsulas. Las enzimas encapsuladas sobreviven al secado al aire en trehalosa y tienen actividad enzimática después de la rehidratación. Las cápsulas semipermeables pudieron comunicarse con su entorno, lo que nos permitió implementar una cascada de señalización de dos capas al inmovilizar las reacciones de desplazamiento de la cadena de ADN dentro del núcleo líquido de dos poblaciones diferentes de microcápsulas6. En conjunto, este trabajo describe el desarrollo y caracterización de microcápsulas semipermeables con cubierta polimérica biocompatible que pueden ser utilizadas para la encapsulación de diferentes biomoléculas para su uso en aplicaciones diagnósticas, terapéuticas o de biología sintética.

Dado que los derivados de PEG generalmente se consideran biocompatibles, bioinertes y biodegradables7, probamos varios PEG-DA de bajo peso molecular, como PEG-DA MW 700, PEG-DA MW 575 y PEG-DA MW 258 como precursores para la producción de microcápsulas. después de la fotopolimerización por iluminación UV. Para PEG-DA con MW 575 o superior, su miscibilidad en agua nos impidió formar fácilmente emulsiones dobles. Leonavicene et al. mostró recientemente que es posible obtener un sistema de dos fases combinando PEG-DA MW 575 y PEG-DA MW 8000 de alto peso molecular en la fase interna y formar cápsulas de núcleo-carcasa usando PEG-DA como material de cápsula8. Sin embargo, consideramos un enfoque alternativo al usar PEG-DA MW 258 como un precursor potencial de polímero debido a su inmiscibilidad con el agua, como también informaron Nam et al.5. Esta propiedad de PEG-DA MW 258 nos permitió usarlo como fase intermedia en emulsiones dobles y fue compatible con la generación de gotas en un dispositivo PDMS (Fig. 1A). Para formar las dobles emulsiones, utilizamos una fase continua acuosa suplementada con 10% de PVA. La fase media de PEG-DA 258 se complementa con un fotoiniciador (HMPP) y un tensioactivo (Span80), con la adición opcional de un disolvente orgánico suave. Producimos emulsiones dobles monodispersas en régimen de chorro con caudales de 2500 \(\upmu \)L/h para la fase continua acuosa, 200 \(\upmu \)L/h para la fase media PEG-DA MW 258, y 250 \(\upmu \)L/h para la fase interna acuosa (Fig. 1B). Curiosamente, las emulsiones dobles podrían generarse sin requerir ningún tratamiento superficial del dispositivo debido a la geometría no plana del dispositivo PDMS que evita que la fase intermedia hidrofóbica humedezca el canal de recolección.

Producción de microcápsulas semipermeables en un dispositivo PDMS con geometría 3D. (A) Representación esquemática del dispositivo PDMS con geometría 3D. Las emulsiones dobles W/O/W se generan con una fase media PEG-DA 258 que encapsula un núcleo acuoso interno. (B) Micrografías del funcionamiento del dispositivo PDMS. (C) Imagen de campo claro de las microcápsulas obtenidas después de la polimerización UV de la doble emulsión recolectada. (D) Distribución del tamaño de un lote representativo de microcápsulas polimerizadas. (E) Representación esquemática de PIPS sobre iluminación UV. Se mezcló acetato de butilo al 15% (porógeno) con PEG-DA 258 para formar microcápsulas semipermeables. (F) En la emulsión doble recogida, tanto el FITC-dextrano de 500 kDa de alto peso molecular como el RITC-dextrano de 40 kDa de bajo peso molecular se retienen en la fase acuosa interna. (G) Después de la polimerización UV y PIPS, se forman poros en la cubierta de la cápsula y las cápsulas se vuelven semipermeables.

Recogimos las emulsiones dobles en una cubeta transparente a los rayos UV durante 15 minutos, después de lo cual las cápsulas se polimerizaron por lotes mediante exposición a los rayos UV. Después de la polimerización obtuvimos cápsulas monodispersas con un diámetro medio de 62 \(\upmu \)m (Fig. 1C,D). El coeficiente de variación fue cercano al 5%, de acuerdo con resultados previos utilizando dispositivos PDMS similares9. A partir de la inspección de imágenes de microscopio, se estimó que la cubierta de la cápsula tenía entre 5 y 10 \(\upmu \)m de espesor. Nuestros resultados no solo confirman la observación de Nam et al.5 de que el PEG-DA MW 258 inmiscible en agua es una fase intermedia adecuada, sino que también demostraron su compatibilidad con la generación de doble emulsión en un dispositivo PDMS que no requiere ningún tratamiento de superficie, y resultó en la producción de microcápsulas poli-PEG-DA 258 monodispersas con cubiertas delgadas porosas (Fig. 1E-G).

Las microcápsulas PEG-DA 258 son semipermeables y el tamaño de los poros se puede ajustar cambiando el porógeno. Representación esquemática de las microcápsulas de PEG-DA 258 producidas usando (A) 15 % de acetato de butilo o (C) 15 % de 1-decanol como porógeno. Las microcápsulas de acetato de butilo al 15% permitieron selectivamente la permeación de RITC-dextrano de 10 kDa mientras excluían EGFP de 32,7 kDa. El mayor tamaño de poro de las microcápsulas producidas con 1-decanol al 15% como porógeno permitió la difusión de ambas moléculas fluorescentes. Las microcápsulas producidas usando (B) acetato de butilo al 15% o (D) porógeno de 1-decanol al 15% se sumergieron en una solución que contenía RITC-dextrano de 10 kDa y EGFP de 32,7 kDa. La evolución de la señal fluorescente en los canales Cy3 y FITC se observó a los 5 min, 1 hy 24 h. Mientras que las microcápsulas producidas con 1-decanol al 15 % eran permeables a ambas moléculas fluorescentes, observamos claramente la permeabilidad selectiva de las microcápsulas producidas con acetato de butilo al 15 % como porógeno.

Para producir cápsulas semipermeables, usamos el solvente inerte suave acetato de butilo agregado a la fase intermedia que actúa como porógeno en PIPS4,10. Kim et al.4 utilizaron acetato de butilo para formar nanoporos con un diámetro inferior a 30 nm en una capa delgada compuesta por una red reticulada de triacrilato de trimetilolpropano etoxilado (ETPTA) y metacrilato de glicidilo (GMA). Para evaluar la permeabilidad de las cápsulas semipermeables, agregamos FITC-dextrano de 500 kDa y TMR-dextrano de 40 kDa a la fase acuosa interna, y observamos que casi el 90% de las cápsulas polimerizadas retuvieron el FITC-dextrano de 500 kDa después de las cápsulas. se lavaron exhaustivamente mediante centrifugación sucesiva en tampón acuoso y luego se incubaron durante 24 h en tampón a 4 \(^{\circ }\)C (Fig. 1G). Por otro lado, sólo alrededor del 40% de las cápsulas retuvieron el TMR-dextrano de 40 kDa de peso molecular más bajo. Estos resultados mostraron que algunas cápsulas son semipermeables, como lo demuestran las cápsulas en las que solo se retiene el fluoróforo de mayor peso molecular. Aunque el límite de tamaño no se pudo determinar con precisión a partir de este experimento, estimamos que estaba muy por debajo de 500 kDa y potencialmente cerca del tamaño del fluoróforo más pequeño de 40 kDa.

Para caracterizar mejor la semipermeabilidad, preparamos cápsulas vacías y las colocamos en una solución de moléculas fluorescentes de menor peso molecular (Fig. 2). Colocamos cápsulas vacías producidas con porógeno de acetato de butilo al 15% en una solución que contenía RITC-dextrano de 10 kDa y EGFP de 32,7 kDa (Fig. 2A, B). Observamos que la mayoría de las cápsulas mostraban un aumento relativamente rápido de la señal en el canal rojo fluorescente, correspondiente al RITC-dextrano de 10 kDa de menor peso molecular. Después de 1 h de incubación, la mayoría de las cápsulas mostraron una señal fluorescente roja y todas las cápsulas mostraron una señal fluorescente roja después de 24 h de incubación. Al mismo tiempo, la mayoría de estas cápsulas no mostraron aumento de señal en el canal fluorescente verde correspondiente al EGFP de 32,7 kDa. Al superponer la señal de los dos canales fluorescentes, pudimos ver claramente que la mayoría de las cápsulas eran semipermeables y excluían EGFP durante al menos 24 h mientras permitían la difusión del RITC-dextrano de 10 kDa en su interior. Sin embargo, observamos cierta variabilidad en la permeabilidad de las cápsulas, ya que algunas cápsulas parecían permeables a EGFP después de unos minutos de incubación, mientras que algunas cápsulas aún excluían RITC-dextrano de 10 kDa después de 1 h.

Obtuvimos cápsulas semipermeables con un corte de diferente tamaño utilizando 1-decanol como porógeno. Kim et al.4 informaron sobre el uso de 1-decanol para crear poros más grandes en la cubierta del polímero ETPTA/GMA debido a un parámetro de interacción diferente del 1-decanol con el polímero en formación. Aquí, mostramos que las cápsulas producidas con 15% de porógeno de 1-decanol en PEG-DA 258 también dieron como resultado una mayor permeabilidad que las cápsulas producidas con el porógeno de acetato de butilo (Fig. 2C, D). Observamos un aumento en la señal fluorescente verde correspondiente a EGFP de 32,7 kDa en el interior de la cápsula después de solo unos minutos de incubación y todas las cápsulas eran fluorescentes después de 24 h. Además, todas las cápsulas eran completamente permeables a RITC-dextrano de 10 kDa. Para modificar la permeabilidad de la cápsula, también exploramos el uso de una fracción más pequeña de porógeno con 10% de acetato de butilo. Observamos que una proporción significativa de las cápsulas no tenía señal fluorescente correspondiente a RITC-dextrano de 10 kDa después de 1 h de incubación, lo que sugiere un límite de permeabilidad más bajo (Fig. S1 complementaria). También usamos diferentes solventes como porógeno, como octanol al 15% (Fig. S2 complementaria), que produjo cápsulas de permeabilidad intermedia entre lo que se observó usando acetato de butilo al 15% o decanol al 15%. Usando 15% de 2-etil-1-hexanol (Fig. S3 complementaria), producimos cápsulas con una permeabilidad comparable al 15% de acetato de butilo. Estos resultados demuestran que es posible modificar la permeabilidad de la cápsula variando el contenido y la composición de porógenos, y que diferentes disolventes son compatibles con nuestra producción microfluídica de cápsulas semipermeables.

Encapsulación directa de proteínas dentro de cápsulas semipermeables de PEG-DA 258. Se añadió EGFP a la fase interna acuosa para la encapsulación directa. (A–C) Imágenes de microscopio de emulsiones dobles que muestran una señal fluorescente en el canal FITC. (D–F) Después de la polimerización, la señal fluorescente todavía estaba presente en el interior de la mayoría de las cápsulas. La variabilidad en el tamaño de poro o un límite de tamaño cercano al EGFP de 32,7 kDa dio como resultado alguna pérdida de proteína. (G) Perfil de intensidad fluorescente de la cápsula indicado en el panel E. El perfil fluorescente sugiere una distribución homogénea de EGFP en el interior de la cápsula sin adsorción de proteínas al material de la cubierta. (H-J) Imágenes de microscopio de cápsulas polimerizadas que contienen FITC-estreptavidina después de la encapsulación directa. La señal fluorescente está presente en todas las cápsulas, lo que sugiere que el tamaño de los poros es demasiado pequeño para la fuga de FITC-estreptavidina. (K) Perfil fluorescente en dos cápsulas del panel I. El perfil sugiere una distribución homogénea de FITC-estreptavidina en el interior de la cápsula sin adsorción de proteínas al material de la cubierta.

A continuación, mostramos que podemos encapsular proteínas directamente en microcápsulas de poli-(PEG-DA 258) semipermeables sin adsorción a la cubierta polimérica o pérdida de función. Seleccionamos acetato de butilo al 15 % como porógeno para permitir la retención de proteínas y enzimas en el interior de las cápsulas, al tiempo que permitía el transporte de biomoléculas más pequeñas a través de la cubierta de la cápsula. Encapsulamos EGFP de 32,7 kDa dentro de nuestras microcápsulas añadiéndolo a una concentración final de 2 \(\upmu \)g/mL a la fase acuosa interna. La señal de fluorescencia de EGFP se observó en la emulsión doble sin ningún signo de precipitación (Fig. 3A-C) y, una vez polimerizadas, las cápsulas mostraron un perfil fluorescente homogéneo sin ningún signo de adsorción de proteínas al material de la cápsula (Fig. 3D- GRAMO). También encapsulamos estreptavidina marcada con FITC de 60 kDa en la fase interna acuosa a una concentración final de 50 \(\upmu \)g/mL, y el perfil de señal fluorescente en las cápsulas polimerizadas no indicó signos de adsorción de proteínas en la cubierta de la cápsula ( Fig. 3H-K). Después de la incubación en PBS durante 24 h, vimos que una proporción de las cápsulas que contenían EGFP no contenían ninguna señal fluorescente (Fig. 3D-F). Esta observación sugiere un límite de permeabilidad cercano al tamaño de estas biomoléculas fluorescentes. También esperamos cierta variabilidad en el tamaño de los poros de las cápsulas debido al proceso de polimerización UV por lotes, durante el cual la intensidad UV podría diferir ligeramente según la posición de la cápsula en la cubeta. Además, algunas cápsulas podrían haberse roto o dañado, lo que provocaría la liberación de su carga. Con el FITC-estreptavidina de mayor peso molecular de 60 kDa, vimos que la mayoría de las cápsulas polimerizadas contenían una señal fluorescente después de los lavados acuosos, lo que indica un límite de tamaño por debajo del tamaño de FITC-estreptavidina.

Demostramos que la cubierta poli-PEG-DA 258 obtenida después de la polimerización UV es compatible con la encapsulación directa de proteínas. Los materiales utilizados no condujeron a la adsorción de proteínas en la cubierta de la cápsula y el proceso de separación de fases inducido por polimerización formó poros suficientemente pequeños para retener proteínas con pesos moleculares de 32,7 kDa y superiores.

Encapsulación directa de enzimas funcionales en microcápsulas semipermeables PEG-DA 258. Una proteína de fusión luciferasa-GFP se encapsuló directamente en cápsulas semipermeables. La proteína de fusión fluorescente permite la visualización de la enzima (A) en la doble emulsión y (B) en las cápsulas polimerizadas. (C) La econoLuciferasa encapsulada muestra una fuerte señal en un ensayo bioluminiscente. Encapsulación directa de \(\beta \)-galactosidasa. (D,E) Las cápsulas que contenían enzimas se dispersaron en trehalosa y se secaron al aire a 37 \(^{\circ }\)C. (F) Después de la rehidratación con una solución que contenía CPRG, el sustrato se hidrolizó a rojo de clorofenol. (G) Se tomaron imágenes de la solución con una cámara a color montada en un microscopio invertido con \(\times \) 4 aumentos. Las cápsulas mostraban un color púrpura en su interior, indicativo de actividad enzimática \(\beta \)-galactosidasa.

Después de la encapsulación exitosa de proteínas fluorescentes, encapsulamos enzimas y realizamos ensayos enzimáticos con las cápsulas producidas. Utilizamos una proteína de fusión GFP-luciferasa recombinante (econoLuciferase, Biosynth), que permitió confirmar la encapsulación midiendo su señal fluorescente. El peso molecular de la proteína de fusión por encima de 90 kDa condujo a la retención de la enzima en el interior de las microcápsulas. De hecho, vimos que tanto la doble emulsión como las cápsulas polimerizadas contenían una señal fluorescente de la proteína de fusión fluorescente econoLuciferase. En ambos casos, observamos una distribución moteada de la señal fluorescente que podría deberse a alguna precipitación en la solución interna de PVA al 10% (Fig. 4A, B). Las cápsulas que contenían econoLuciferasa se colocaron en una solución que contenía D-luciferina y medimos una señal bioluminiscente dos órdenes de magnitud más alta que la señal observada para las cápsulas vacías (Fig. 4C). Estos resultados demostraron que una enzima activa se puede encapsular en microcápsulas de poli-PEG-DA 258, con la cubierta semipermeable que permite la difusión del sustrato D-Luciferina en el núcleo de las microcápsulas para generar una señal bioluminiscente.

En un segundo ejemplo, mostramos que las cápsulas se pueden secar y rehidratar mientras se conserva la función enzimática. Encapsulamos \(\beta \)-galactosidasa, una enzima tetramérica con un peso molecular de 465 kDa. Para demostrar que las cápsulas que contienen enzimas se pueden secar y conservar la actividad tras la rehidratación, dispersamos cápsulas que contienen \(\beta \)-galactosidasa en una solución de trehalosa 0,5 M y secamos pequeñas gotas durante la noche en una incubadora a 37 \(^{\ circ }\)C dando como resultado gránulos de trehalosa (Fig. 4D,E). Después de rehidratar los gránulos secos con una solución de Chlorophenolred-\(\beta \)-d-galactopyranoside (CPRG), observamos un cambio de color tras la conversión enzimática del CPRG amarillo a clorofenol rojo. Observamos que el cambio de color se produjo en la ubicación de las cápsulas, y la visualización con un objetivo de 4x mostró que el interior de algunas cáspulas se tornó de un color rojo púrpura intenso (Fig. 4F, G). Aunque las imágenes no se usaron como una cuantificación de la concentración de rojo de clorofenol, mostraron claramente que la conversión de CPRG a rojo de clorofenol ocurrió dentro de las cápsulas que contenían \(\beta \)-galactosidasa. Estos resultados demostraron la posibilidad de la encapsulación directa de enzimas activas en microcápsulas semipermeables y, además, demostramos que las cápsulas se pueden secar al aire en una solución lioprotectora de trehalosa y aún así conservar su actividad después de la rehidratación.

Inmovilización de la red de reacción de desplazamiento de cadena de ADN en microcápsulas semipermeables e implementación de una cascada de señalización de dos capas. (A) Representación esquemática de la cascada de señalización de dos capas desarrollada por Joesaar et al.6 (B) Implementación de la cascada de señalización de dos capas en cápsulas de poli-PEG-DA 258. Las dos poblaciones de cápsulas se mezclaron y se tomaron imágenes en un portaobjetos de recuento de células inmediatamente después de la adición de la cadena de entrada 50 nM (A). Se observó un aumento en las señales fluorescentes Cy5 y Cy3 correspondientes a la activación de la primera y segunda población, respectivamente. (C) Intensidad media de las partículas detectadas. Se observó un aumento en la señal de Cy5 correspondiente a la primera población de cápsulas activada. Después de la liberación y difusión de la hebra de señal (\(Q_1\)) a la segunda población de cápsulas, se observó un aumento en la señal de Cy3 correspondiente a su activación posterior. Los símbolos más grandes corresponden a la mediana de todas las partículas detectadas en un canal fluorescente determinado.

Investigamos la posibilidad de encapsular sistemas biomoleculares más complejos, ya que esto podría usarse para detectar y responder a un estímulo en aplicaciones diagnósticas, terapéuticas o teranósticas. Recientemente se demostró que las reacciones de desplazamiento de cadena de ADN (DSD) se pueden realizar en microcompartimentos de proteinosoma11 como modelo de comunicación protocelular y computación biomolecular distribuida6. Aquí, inmovilizamos hebras de ADN biotiniladas en nuestras cápsulas de poli-(PEG-DA 258) que contenían estreptavidina, siguiendo el diseño de Joesaar et al.6.

Implementamos una cascada de señalización de dos capas mediante la funcionalización de una primera población de cápsulas con una compuerta DSD transductora que se activa después del desplazamiento del punto de apoyo por una hebra de entrada de ssDNA (A), lo que conduce a la liberación de una hebra de señal (Q1) y a la inactivación de una fluoróforo Cy5. La hebra de señal (Q1) puede, a su vez, activar una segunda población de cápsulas funcionalizadas con una puerta DSD transductor-amplificador que libera una segunda hebra de señal (Q2), esta vez inactivando un fluoróforo Cy3. También agregamos un hilo de combustible que actúa como amplificador (Fig. 5A). Las dos poblaciones de cápsulas se mezclaron y la cascada de señalización de dos capas se activó tras la adición de la hebra de entrada (A). En este experimento, mezclamos las dos poblaciones de cápsulas, agregamos una cadena de entrada de 50 nM (A) y cargamos las cápsulas que se mueven libremente en una cámara de recuento de células. Primero medimos un aumento de la señal de Cy5 correspondiente a la primera población de cápsulas que contenían la activación de la primera puerta del transductor DSD. Después de un retraso de unos minutos, vimos un aumento posterior en la señal de Cy3 correspondiente a la segunda población de cápsulas que contenían la puerta DSD del transductor-amplificador (Fig. 5B, C). Observamos un aumento de Cy5 en unas 10 cápsulas de la primera población y un aumento de Cy3 en unas 15 cápsulas de la segunda población. La activación de la cascada de dos capas podría modificarse cambiando la concentración de la hebra de entrada (A). Al aumentar su concentración a 100 nM, la activación de la primera población se aceleró en gran medida y fue difícil capturar el aumento de la señal inicial (Fig. S4 complementaria). Por otro lado, reducir la concentración de (A) a 10 nM condujo a un nivel de activación mucho más bajo (Fig. S4 complementaria). En todos los casos, observamos un retraso de 5 a 10 min entre la activación de la primera población y la activación de la segunda población. Si bien esta es una implementación sucinta de las reacciones DSD compartimentadas recientemente desarrolladas, estos resultados demostraron que las reacciones DSD pueden encapsularse de manera eficiente en nuestras microcápsulas semipermeables y emplearse para construir sistemas biomoleculares comunicantes.

En este trabajo, presentamos la producción de microcápsulas de poli-PEG-DA 258 biocompatibles y semipermeables y su uso para la encapsulación de proteínas o redes de ADN conservando la funcionalidad. Primero, mostramos que PEG-DA 258 se puede usar como una fase intermedia polimerizable para la producción de microcápsulas moldeadas a partir de una emulsión doble de agua en PEG-DA 258 en agua. La generación de dicha doble emulsión no requiere el uso de un dispositivo capilar de vidrio5, pero se puede producir en un dispositivo PDMS con geometría 3D que no requiere ningún tratamiento superficial12. El método relativamente simple y la reproducibilidad en la fabricación y el uso de dispositivos PDMS sin tratar para la producción de microcápsulas de poli-PEG-DA 258 deberían hacer que este método esté disponible para muchos laboratorios con acceso a la fabricación básica de litografía blanda.

Al agregar un diluyente inerte a la fase media de PEG-DA 258, mostramos que las PIPS pueden formar microcápsulas semipermeables. Esta técnica se utilizó anteriormente en la formación de microcápsulas semipermeables hechas de otros polímeros a base de acrilato, como mezclas de ETPTA/GMA4 o EDGMA/GMA10. Si bien se demostró la semipermeabilidad de las cápsulas fabricadas con dichos polímeros, no se logró la encapsulación directa de los componentes biológicos, aparte de la encapsulación del ADN plasmídico en las microcápsulas ETPTA/GMA de Niederholtmeyer et al.13. Es interesante señalar que el ADN plasmídico contenido en estas cápsulas aún podría servir como molde de expresión de proteínas después de la inmersión en un sistema de traducción de transcripción sin células. Sin embargo, la cápsula de ETPTA/GMA tuvo que reaccionar primero con amino-PEG12-alcohol para evitar la adsorción de proteínas en la cubierta de la cápsula, lo que también indica que la encapsulación directa de proteínas o enzimas se habría evitado mediante el uso de tales polímeros.

Aquí, confirmamos la observación previa de Nam et al.5 de que las microcápsulas de poli-PEG-DA 258 no conducen a la adsorción de biomoléculas, incluidas proteínas fluorescentes o enzimas, lo que permite su encapsulación directa en el interior de las microcápsulas semipermeables. Además, se estimó que los pequeños poros obtenidos por PIPS al usar acetato de butilo como porógeno estaban cerca o incluso eran más pequeños que el radio hidrodinámico del EGFP pequeño de 32,7 kDa. Esto permitirá la encapsulación de una variedad de proteínas, ARN, ADN u otras (bio)moléculas de interés siempre que su tamaño no sea menor que este límite. Mostramos que la encapsulación de enzimas activas es posible y que la semipermeabilidad de las cápsulas supera los desafíos de la encapsulación estable sin liberación de la enzima, mientras que al mismo tiempo permite la difusión de reactivos y productos dentro y fuera de las cápsulas. Alternativamente, proponemos que la encapsulación de estreptavidina puede servir como socio de inmovilización para moléculas más pequeñas. Además, la encapsulación de perlas o partículas magnéticas funcionalizadas de tamaño apropiado podría usarse para el mismo propósito. En desarrollos futuros, esto podría servir para inmovilizar péptidos y proteínas pequeñas con etiquetas de afinidad, o incluso moléculas pequeñas, que podrían activarse o liberarse al detectar un estímulo externo14. Aquí aplicamos este concepto mediante la inmovilización de cadenas cortas de ADN modificadas con un mango de biotina en estreptavidina encapsulada, que sirvió en la implementación de una cascada de señalización de dos capas a partir de reacciones de desplazamiento de cadena de ADN (DSD). Si bien la implementación de reacciones DSD en microcompartimentos propuesta por Joesaar et al.6 se realizó originalmente en proteinosomas, mostramos que nuestras microcápsulas semipermeables también son capaces de implementar una aplicación de biología sintética tan compleja.

Este trabajo es la primera demostración de la encapsulación directa de biomoléculas activas en cápsulas semipermeables biocompatibles de poli-PEG-DA 258, pero con algunas limitaciones. Si bien el método de encapsulación y los parámetros seleccionados fueron adecuados para las aplicaciones elegidas, reconocemos que se podrían realizar mejoras para aumentar el rendimiento de las microcápsulas intactas y obtener un límite de semipermeabilidad específico. La eliminación efectiva de porógeno en lavados acuosos y otros procesos posteriores que afectan la permeabilidad de la cápsula se puede mejorar aún más para producir cápsulas más homogéneas. Dado que el control de la iluminación UV que inicia el proceso de polimerización es fundamental para PIPS y genera la permeabilidad deseada, los desarrollos futuros podrían utilizar la polimerización en línea15 para producir cápsulas que garanticen una iluminación uniforme de cada gota de doble emulsión. Finalmente, será necesario igualar la densidad entre las diferentes fases, modificar el grosor de la cubierta, así como explorar diferentes composiciones de porógenos, tensioactivos y fotoiniciadores para producir cápsulas con propiedades adaptadas para otras aplicaciones específicas.

En conclusión, demostramos la encapsulación en un solo paso de una variedad de biomoléculas en microcápsulas de poli-PEG-DA 258 moldeadas a partir de emulsiones dobles. Las moléculas fluorescentes, proteínas, enzimas y hebras de ADN con actividad biológica se pueden cargar en el núcleo de las cápsulas semipermeables biocompatibles. Esto abre las puertas hacia la construcción de células artificiales biomoleculares multicomponentes robustas y complejas con aplicaciones de biología sintética, terapéutica y de diagnóstico.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, FR y Landfester, K. Liposomas y polimerosomas: una revisión comparativa de la imitación de células. química Soc. Rev. 47, 8572–8610 (2018).

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Los autores agradecen a Rohan Thakur por su contribución en la configuración de las bombas de jeringa y por sus contribuciones en el desarrollo de la plataforma inicial. Agradecen a la profesora Esther Amstad, Jui-Chia Chang, el Dr. Gianluca Etienne y el laboratorio SMaL de la EPFL por proporcionarnos la fotomáscara del dispositivo de microfluidos y por su ayuda con los experimentos preliminares. GM recibió el apoyo del programa MD-PhD de la Swiss National Science Foundation (SNF, 323530\(\_\)171144) y de SNF NRP (National Research Program) 78 Covid-19 Grant 198412 (para SJM). Este trabajo fue publicado como parte de la tesis de doctorado de EPFL MD-PhD No. 838516.

Escuela de Ingeniería, Instituto de Bioingeniería, Escuela Politécnica Federal de Lausana, Lausana, Suiza

Gregory Michelin y Sebastian J. Maerkl

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investigación diseñada por GM y SJM; GM realizó investigaciones; GM y SJM analizaron resultados y datos; GM y SJM escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Sebastián J. Maerkl.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Michielin, G., Maerkl, SJ Encapsulación directa de biomoléculas en microcápsulas semipermeables producidas con dobles emulsiones. Informe científico 12, 21391 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25895-8

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Recibido: 21 de septiembre de 2022

Aceptado: 06 diciembre 2022

Publicado: 10 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25895-8

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