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BMC Medicine volumen 20, Número de artículo: 292 (2022) Citar este artículo

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Aunque el metabolismo del colesterol es una vía común para el desarrollo de fármacos antitumorales, no existen objetivos específicos ni fármacos para uso clínico. Aquí, con base en nuestro estudio previo de la esterol O-aciltransferasa 1 (SOAT1) en el carcinoma hepatocelular, buscamos detectar un fármaco dirigido eficaz para el tratamiento preciso del carcinoma hepatocelular y, desde la perspectiva del metabolismo del colesterol, aclarar la relación entre la regulación del colesterol y tumorigénesis y desarrollo.

En este estudio, desarrollamos una tecnología de detección de afinidad integrada de detección virtual para la detección de fármacos de proteína diana. Se utilizaron una serie de experimentos in vitro e in vivo para verificar la actividad del fármaco. Se utilizaron análisis multiómicos y análisis de citometría de flujo para explorar los mecanismos antitumorales. El análisis comparativo del proteoma y el transcriptoma combinado con la información de seguimiento de la supervivencia de los pacientes revela el potencial terapéutico clínico de los fármacos seleccionados.

Examinamos tres compuestos, nilotinib, ABT-737 y evacetrapib, que exhibieron una unión óptima con SOAT1. En particular, nilotinib mostró una alta afinidad por la proteína SOAT1 e inhibió significativamente la actividad tumoral tanto in vitro como in vivo. El análisis multiómico y el análisis de citometría de flujo indicaron que los compuestos dirigidos a SOAT1 reprogramaron el metabolismo del colesterol en los tumores y mejoraron las células T CD8+ y los neutrófilos para suprimir el crecimiento tumoral.

En conjunto, informamos sobre varios ligandos SOAT1 de alta afinidad y demostramos su potencial clínico en la terapia de precisión del cáncer de hígado, y también revelamos el mecanismo antitumoral potencial de los compuestos dirigidos a SOAT1.

Informes de revisión por pares

Estudios previos han encontrado que la reprogramación del metabolismo del colesterol tumoral ocurre durante la tumorigénesis y el desarrollo [1, 2]. Las características del metabolismo del colesterol de los tumores incluyen tanto la regulación positiva de la síntesis y la absorción de colesterol como la acumulación de varios derivados del colesterol, como los ésteres de colesterol y el colesterol oxidado [3]. Sin embargo, la reprogramación del metabolismo del colesterol en los tumores involucra muchos procesos, que incluyen síntesis, captación, esterificación, eflujo y conversión. Por lo tanto, dilucidar el papel de estos procesos en la tumorigénesis y en el desarrollo de fármacos terapéuticos potenciales ha sido un desafío.

Muchos estudios clínicos y preclínicos recientes han demostrado que atacar el metabolismo del colesterol en las células tumorales y las células inmunitarias es una forma obvia de tratar los tumores [4]. Los objetivos existentes incluyen enzimas clave en la síntesis de colesterol y vías de transporte, así como factores de transcripción clave involucrados en el metabolismo del colesterol. Por ejemplo, las estatinas ejercen efectos anticancerígenos al inhibir la actividad de la enzima limitante clave 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa (HMGCR) en la vía de señalización de la síntesis de colesterol [5], y el itraconazol se une directamente al esterol- dominio sensible del transportador de colesterol intracelular NPC 1 (NPC1), lo que reduce el crecimiento tumoral y la angiogénesis [6]. Además, LXR-623, GW3965, otros inhibidores de molécula pequeña contra el receptor X del hígado (LXR) y otros fármacos de molécula pequeña también se están investigando actualmente como fármacos antitumorales [7].

Se espera que el descubrimiento de nuevos objetivos farmacológicos relacionados con el colesterol acelere el desarrollo de fármacos dirigidos a la homeostasis del colesterol intracelular para la terapia tumoral. La proteína SOAT1 puede convertir el exceso de colesterol intracelular en éster de colesterol y almacenarlo en gotitas de lípidos. La eliminación o inhibición de SOAT1 puede inhibir una variedad de tumores al regular la homeostasis del colesterol en las células tumorales [8, 9] y el estado inmunitario del microambiente tumoral [10, 11]. Anteriormente descubrimos que SOAT1 se puede usar para estratificar a los pacientes con HCC con mal pronóstico y como un objetivo farmacológico para el tratamiento de pacientes con este subtipo. Se ha demostrado que los inhibidores dirigidos a SOAT1 ejercen efectos antitumorales óptimos tanto in vitro como in vivo. Sin embargo, solo hay unos pocos inhibidores de SOAT1 conocidos (solo se han informado avasimiba, nevanimiba y CI-976), lo que limita en gran medida sus perspectivas de desarrollo de fármacos.

Al reconocer el potencial de la proteína SOAT1 en la terapia tumoral, varios equipos internacionales han informado sucesivamente sobre la estructura cristalina precisa de SOAT1, lo que brinda una nueva oportunidad para el desarrollo de fármacos basados ​​en proteínas diana [12, 13]. El objetivo principal de esta investigación era continuar con el trabajo preliminar del laboratorio y desarrollar una tecnología de detección de ligandos de alto rendimiento para la identificación de posibles dianas terapéuticas de la proteína SOAT1 para pacientes con cáncer de hígado S-III. Además, investigamos el vínculo intrínseco entre la regulación del colesterol y la tumorigénesis y el desarrollo con el fin de proporcionar nuevos conocimientos para el tratamiento preciso del cáncer de hígado.

Las líneas celulares de carcinomas hepatocelulares humanos HepG2, Hep3B y Huh7 se obtuvieron de ACTT con el número ACTT: HB-8065, HB-8064 y PTA-4583. La línea celular de carcinoma hepatocelular de ratón Hepa1-6 se obtuvo de ACTT con número de ACTT: CRL-1830. Las células HEK293T se obtuvieron de ACTT con número de ACTT: CRL-3216. Las células Expi293F™ se obtuvieron de Thermo Scientific con Cat#A14527. Todas las células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Thermo Fisher Scientific) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS; Thermo Fisher Scientific), 100 μg/ml de estreptomicina y 100 unidades/ml de penicilina (Thermo Fisher Scientific) a 37 °C con 5 % de CO2. Las células se sometieron a pases o se recolectaron mediante incubación con 1 × TrypLE Express (Life Technologies) a 37 °C durante 2 y 5 min.

Los protocolos experimentales y de cuidado de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Nacional de Ciencias de Proteínas (Beijing), número de revisión ética: IACUC-20210914-32MT. Se adquirieron ratones NOD-SCID y C57BL/6 J de Charles River, Inc (Beijing, Vital River Laboratory Animal Technology). Todos los ratones eran ratones hembra de 4 a 5 semanas. Después del trasplante del tumor, el tumor creció hasta 100 mm3 y comenzó a dividirse aleatoriamente en tres grupos: control (200 μL-30% PEG400 + 0,5% Tween 80 + 5% propilenglicol, inyección intraperitoneal), sorafenib (20 mg kg−1 día −1, inyección intraperitoneal), nilotinib (20 mg kg−1 día−1, inyección intraperitoneal). Después del tratamiento durante 28 días, los ratones fueron sacrificados por dislocación espinal. El investigador desconocía la medicación del grupo durante el experimento y al evaluar el resultado. Los animales se alojaron en una instalación específica para ratones libre de patógenos en el centro de animales National Center for Protein Sciences (Beijing). El tamaño máximo del tumor del modelo de ratón CDX del criterio de valoración experimental es inferior a 20 mm en cualquier dimensión, de acuerdo con la IACUC. Ninguna de las pautas fue excedida en ningún experimento realizado. El tamaño del tumor se midió usando un calibrador. El volumen tumoral en mm3 se calculó mediante la fórmula: volumen tumoral = 0,5 × largo × (ancho)2.

La estructura cristalina de la proteína SOAT1 se obtuvo del Research Collaboration for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB) (código de proteína PDB: 6VUM y 6L47) [12, 13]. La base de datos de compuestos de detección contiene 31 276 compuestos reconocidos por la FDA obtenidos de Selleck (https://www.selleck.cn/screening-libraries). El tamizaje virtual se realizó utilizando el método informado anteriormente. Específicamente, utilizamos tres software de acoplamiento ampliamente aceptados, AutoDock 4.2 [14], sybyl 2.0 [15] y Glide [16] para el acoplamiento molecular de alto rendimiento. Para el acoplamiento molecular con autoDock, primero cargamos la estructura cristalina 3D de la proteína, agregamos hidrógenos polares y deshidratamos y optimizamos la energía, y luego creamos un bolsillo de celosía para acomodar todo el sitio catalítico SOAT1. Los compuestos también se someten a hidrogenación polar y adición de carga, y optimización de energía para generar la molécula a acoplar. El método de acoplamiento adopta el modo de acoplamiento flexible. Luego, las pequeñas moléculas en la biblioteca de compuestos se acoplaron dentro de los bolsillos del sitio catalítico a través de un algoritmo genético y se clasificaron de acuerdo con la función de energía libre clásica. Estos archivos de entrada, incluida la estructura de la proteína, la caja de bolsillo activa y la carga parcial de Gasteiger, se configuraron con los parámetros predeterminados. El acoplamiento Sybyl 2.0 se realizó utilizando el módulo Surflex-dock. En primer lugar, las moléculas de la biblioteca de proteínas y compuestos se polarizaron, hidrogenaron, cargaron y optimizaron energéticamente. La bolsa de interfaz se centró en el rectángulo de 15 Å con las coordenadas del residuo His460 en el sitio catalítico SOAT1. El método de acoplamiento semiflexible utilizó la puntuación integrada como función de puntuación. El módulo de acoplamiento Glide se implementó en la versión 2015–4 de Schrödinger. Primero usamos el módulo del asistente de preparación de proteínas para agregar un hidrógeno polar, cargar y eliminar el agua de la proteína SOAT1. Luego, el sitio de unión se definió como un rectángulo de 15 Å centrado en las coordenadas del residuo His460 del sitio catalítico SOAT1. Al mismo tiempo, se utilizó el módulo LigPrep con parámetros predeterminados para procesar todos los compuestos seleccionados. Para el paso de acoplamiento Glide, seleccionamos la precisión estándar (SP) y la súper precisión (XP) para el acoplamiento molecular. El acoplamiento del ligando adopta un acoplamiento flexible y la energía se minimiza. Finalmente, utilizamos GlideScore como función de puntuación. La postura de acoplamiento Glide XP se utilizó para mostrar el resultado final del acoplamiento, y PyMOL 2.3 [17] completó las imágenes de los resultados.

La expresión y purificación de la proteína SOAT1 se refieren al método informado anteriormente [12, 13]. Específicamente, clonamos el ADNc de la SOAT1 humana (secuencia de referencia NCBI NM_003101.6) en un vector pCAG con una etiqueta de 6 × His en el extremo carboxilo. Las células en suspensión HEK293F se cultivaron en medio Freestyle 293 (Thermo Fisher Scientific) en una incubadora a temperatura constante a 37 °C y con 5 % de CO2 y 80 % de humedad. Cuando la densidad celular alcanzó 2 × 106 células por mililitro, las células se transfectaron transitoriamente con el plásmido de expresión y polietilenimina. Se mezclan previamente aproximadamente 1 mg de plásmido de expresión y 3 mg de polietilenimina (Sigma-Aldrich) en 50 ml de medio fresco y se incuban durante 15 a 30 minutos antes de la transfección. Luego, se agregaron 50 ml de la mezcla a 1 l de cultivo celular y se incubó durante 15 a 30 min. Las células transfectadas se recogieron después de incubar durante 48 h. Para purificar SOAT1, las células HEK293F recolectadas se resuspendieron en un tampón que contenía Tris 25 mM pH 8,0, NaCl 150 mM (tampón A) y una mezcla de inhibidores de proteasa (aproximadamente 1 g de células más 5–10 ml de tampón A). Después de la sonicación en hielo, el sedimento de la membrana celular se recogió y se pesó mediante centrifugación a 120 000 g en una centrífuga de ultra alta velocidad a 4 °C durante 2 h. La fracción de membrana se sometió a Tris 25 mM pH 8,0, NaCl 150 mM y glicodiosgenina al 1 % (p/v) (GDN, Anatrace) (tampón B) disueltos durante 2 h. Después de centrifugar a 120.000 g durante 1 h, se buscó el sobrenadante y se aplicó a la columna de níquel para la purificación por afinidad y se lavó con un tampón de lavado que contenía Tris 25 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, imidazol 40 mM y GDN al 0,02 % (tampón C ). La proteína se eluyó con un tampón que contenía Tris 25 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, imidazol 400 mM y GDN al 0,02% (Tampón D). Luego, el eluato se concentró y purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SuperdexTM200 10/300 gL, GE Healthcare) en un tampón que contenía Tris 25 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM y GDN al 0,02 % (tampón E), y luego se purificó. La concentración de proteína y la detección de SDS-PAGE, la concentración de proteína y la detección de pureza a través del estándar (pureza > 95 %) se pueden dividir y almacenar a −80 ℃ para uso futuro.

Se utilizó un biosensor óptico Biacore T200 (GE Healthcare) para la detección de afinidad de las proteínas diana y la determinación de las mediciones del valor de la constante de disociación de equilibrio (KD) para las interacciones proteína-ligando. Se utilizó el chip CM5 (GE Healthcare) para acoplar la proteína objetivo, y el tampón de ejecución fue una solución salina tamponada con fosfato (PBS, Sigma-Aldrich) que contenía un 5 % de dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich). Antes del acoplamiento, el canal del chip se activó con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, GE Healthcare) y N-hidroxisuccinimida (NHS, GE Healthcare) a un caudal de 10 μL/min durante 60 s. Después de eso, la proteína SOAT1 expresada y purificada de forma recombinante se diluyó con tampón de acetato de sodio 10 mmol/l (pH 5,0) hasta aproximadamente 50 mg/ml. La velocidad de flujo para la solución de proteína SOAT1 fue de 10 μL/min y el tiempo de inyección duró 120 s. El volumen de acoplamiento de proteínas del canal fue de aproximadamente 8000 RU, y el canal se selló con etanolamina a una velocidad de flujo de 10 μL/min durante 120 s. Para la selección de la biblioteca de fragmentos moleculares, la concentración de cada compuesto se diluyó a 100 nmol/L con tampón de funcionamiento en una placa de medición de 96 pocillos y luego se pasó a través del chip CM5 acoplado a la proteína objetivo a una velocidad de flujo de 30 μL/min. durante 180 s. Después de especificar una muestra, el chip se regeneró con NaOH a un caudal de 30 μL/min durante 60 s. Todos los datos brutos fueron registrados y almacenados. Al determinar el valor KD de la afinidad de la interacción proteína-ligando, cada compuesto se diluyó 11 veces de 20 μM a 0.0195 nM, y las moléculas pequeñas se pasaron a través del chip acoplado a la proteína objetivo de baja concentración a alta concentración. El caudal fue de 30 μL/min y la duración fue de 180 s. Después de que fluyó cada punto de concentración, el chip se regeneró con NaOH a una velocidad de flujo de 30 μL/min durante 60 s, y luego se registraron y guardaron los datos en tiempo real. El ajuste del peso molecular y la corrección del solvente se usaron simultáneamente para eliminar los efectos moleculares de deriva de la señal y la unión no específica. Finalmente, todo el procesamiento de datos se realizó en el software de análisis Biacore T200 (GE Healthcare).

Para determinar el efecto del compuesto sobre la viabilidad de las células de cáncer de hígado, se usó el kit CCK-8 (Sigma-Aldrich) para detectar la viabilidad celular. Se cultivaron células de cáncer de hígado HepG2, Hep3B y Huh7 en una placa de 96 pocillos, usando DMEM que contenía 10 % de FBS, 100 μg/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina, en una incubadora a 37 °C, 5 % de CO2 12 h , la concentración de un solo compuesto se diluyó 10 veces desde 20 μM, y cada punto de concentración se repitió 3 veces. El compuesto diluido se añadió al medio sin suero para tratar las células durante 48 h y, a continuación, se evaluó la actividad de las células con el kit CCK-8, consultando el manual de instrucciones del método experimental. Una vez que el lector de microplacas Tecan detecta todos los valores de absorbancia, la IC50 del fármaco en las células se calcula de acuerdo con el valor de concentración-absorbancia en GraphPad (GraphPad Prism 8.2.1, GraphPad).

El experimento de proliferación celular se llevó a cabo con xCELLigence RTCA DP (Roche), y se utilizó la placa de detección de células E-plate-16 (Roche) para el cultivo celular y la detección. Específicamente, las células HepG2, Hep3B y Huh7 primero se convierten en una suspensión celular y se cuentan, y la concentración celular se diluye a 8 × 104 células/L para su uso posterior. Después de agregar 50 μL de medio a los pocillos de E-plate-16 para la detección de línea de base, se agregaron 100 μL de suspensión de células reconciliadas a los pozos para hacer que el número de células por pozo sea de 8000 células/100 μL. Después de permanecer en el banco limpio durante 30 minutos a temperatura ambiente, la placa E-16 se vuelve a colocar en la estación RTCA para realizar la prueba. El programa de trabajo está configurado para detectar el índice celular una vez cada 15 minutos, registrar el proceso de crecimiento celular, pausar el programa después de cultivar durante 3 a 4 h, agregarle los medicamentos preparados (la concentración de cada medicamento se refiere al valor IC50 de la determinación de la viabilidad celular), y continuar el cultivo y la observación. Después de agregar el fármaco, el programa se configura para detectar el índice celular una vez cada 15 min y observar y registrar continuamente durante 120 h. La curva de índice de crecimiento celular-tiempo finalmente se dibujó en GraphPad Prism 8.2.1.

El efecto del fármaco sobre la migración de células de cáncer de hígado se realizó mediante un ensayo de migración transwell clásico. Se tomaron células HepG2, Hep3B y Huh7 en fase de crecimiento logarítmico y se ajustó el número de células a 1 × 106 con medio DMEM sin suero. Se inocularon doscientos microlitros de células en la cámara superior de Transwell (Millipore). Se añadieron a la cámara 600 microlitros de medio DMEM que contenía FBS al 20%. Después de cultivar en una incubadora de CO2 al 5 % a 37 °C durante 12 h, se añadió el fármaco para analizarlo en las cámaras superior e inferior del transwell. La concentración del fármaco deberá consultarse el IC50 o el doble de la concentración determinada anteriormente. Después de cultivar durante 24 h, se retiró el transwell con un hisopo de algodón. Las células que no penetraron en la cámara se fijaron con metanol durante 15 min, se lavaron con PBS 3 veces, se tiñeron con cristal violeta durante 30 min y se fotografiaron en cinco campos de visión diferentes desde arriba, abajo, izquierda y derecha bajo un × 100 microscopio óptico, y se calculó el número medio de células. Tasa de inhibición del fármaco en la migración celular = (1 grupo de adición/grupo de control) × 100 %.

En el ensayo del ciclo celular, se utilizó citometría de flujo para detectar las células teñidas con yoduro de propidio (PI). Las células se fijaron (aproximadamente 2 × 106) en tampón helado con etanol al 70%. Luego, las células se lavaron y se resuspendieron con PBS. Finalmente, se añadió a las muestras una solución de reacción con 25 mg/mL de PI (CWBIO, Beijing, China) y 50 mg/mL de RNasa A y se incubaron en la oscuridad durante 30 min a 37 °C para teñir el ADN. La fluorescencia emitida por el PI-DNA de células individuales se midió utilizando un citómetro de flujo FACS BD LSRFortessa (BD, EE. UU.).

Las células HepG2 y Hep3B se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1 × 103 células/pocillo y se incubaron durante 24 h. Las células se trataron con nevanimiba (5 μM) y nilotinib (500 nM) y DMSO como control. Las células se incubaron durante 8 días. El medio se retiró con cuidado y las células se lavaron con PBS y se fijaron con metanol al 100 % durante 30 min. Después de eliminar el metanol, las células se tiñeron con cristal violeta al 0,5 % (p/v) durante 30 min y se lavaron con agua del grifo. La placa se secó a 25 °C y se capturaron las imágenes. El área manchada se midió automáticamente usando ImageJ. Este experimento se realizó de forma independiente 3 veces. El área de la colonia se calculó como un porcentaje del área total del pozo.

En este estudio, se utilizaron células de carcinoma hepatocelular HepG2 humano y Hepa1-6 murino en nuestro modelo de tumor de xenotrasplante murino, y se usaron ratones NOD-SCID con inmunodeficiencia y ratones C57BL/6 J normales (Tecnología Animal de Laboratorio Vital River de Beijing) para modelar células. -xenoinjertos derivados. Resuspendimos 5 × 106 células en 200 μl de PBS estéril e inyectamos las células resuspendidas en el flanco derecho de cada NOD-SCID o C57BL/6 J (mujer, 4–5 semanas de edad). Una vez que el tumor alcanzó los 100 mm3, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos. En este experimento, se evaluó la eficacia de nilotinib y sorafenib al mismo tiempo, y se estableció un grupo de control con placebo (n = 6 para cada modelo). La dosificación de los tres fármacos fue de 20 mg/kg/día y los fármacos se administraron a los ratones mediante inyección intrapulmonar. Se esperaba que la administración continuara durante 4 semanas y se midió el tamaño del tumor en días alternos. Los ratones fueron asesinados por dislocación espinal. Durante el experimento y al evaluar el impacto, el investigador desconocía la medicación del grupo. Los animales se alojaron en las instalaciones para ratones libres de patógenos en el Centro Nacional de Ciencias de Proteínas (Beijing, China) del Centro Animal. De acuerdo con nuestro protocolo del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), el tamaño máximo del tumor del modelo de ratón CDX no debe exceder los 20 mm en ningún tamaño. En este estudio se siguieron todas las pautas. Se usaron calibradores Vernier para medir el tamaño del tumor. Se utilizó la siguiente fórmula para calcular el volumen del tumor en mm3: volumen del tumor = 0,5 × largo × (ancho)2.

Para las muestras ómicas, se usaron células HepG2 cultivadas en fase logarítmica para los experimentos. Después de que las células se cultivaron a 37 °C y 5 % de CO2 durante 12 h, se agregaron dos compuestos de nevanimiba y nilotinib a cada placa (la dosificación se refiere a la IC50 antes mencionada), y el grupo de control fue igual a 1/1000 One DMSO, y luego continuar incubando durante 12 h. Para el análisis del proteoma, las células se cultivaron en placas de 75 cm2. Cada muestra proporcionó 5 × 10e6 células, y cada grupo se repitió tres veces. En el análisis del metabolismo, las células se cultivaron en placas de 150 cm2. El número de celdas en cada muestra fue de 1 × 10e7, y cada grupo se repitió seis veces. Se usó el contador de células automático Bio-Rad TC20TM (Bio-Rad) para contar todas las células.

Según las siguientes condiciones experimentales, las células HepG2 se dividieron en tres grupos: (1) tratamiento con nevanimiba, (2) tratamiento con nilotinib y (3) tratamiento con DMSO. Cada grupo contiene tres copias biológicas. Los métodos de detección de extracción de proteínas, digestión, separación de péptidos y cromatografía líquida de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) fueron aproximadamente los mismos que nuestros métodos de investigación anteriores. Brevemente, la muestra se lisó ultrasónicamente con tampón de lisis y luego se centrifugó a 12 000 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de centrífuga y la concentración de proteínas se determinó mediante un kit de ensayo de proteínas con ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific). Se digirió enzimáticamente la misma cantidad de proteína en cada muestra, y los péptidos digeridos por tripsina se desalinizaron con Phenomenex y luego se liofilizaron al vacío. Los péptidos se disolvieron en la fase móvil A de cromatografía líquida (solución acuosa de ácido fórmico al 0,1 % (v/v)) y luego se separaron usando el instrumento de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) nanoflow (Easy nLC1000 System, Thermo Fisher) acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher) con una fuente de iones de nanoelectrospray (Thermo Fisher). La fase móvil A es una solución acuosa que contiene 0,1 % de ácido fórmico y 2 % de acetonitrilo; el tampón B es una solución acuosa que contiene 0,1 % de ácido fórmico y 90 % de acetonitrilo. Los datos de espectros de masas se buscaron utilizando ProteomeDiscover 2.0 y MaxQuant 1.6.1.0 y se compararon en la base de datos de proteoma humano SwissProt. El cotejo también usó la anti-base de datos para eliminar la tasa de falsos positivos (FDR) causada por el cotejo aleatorio. La proteasa se fijó en tripsina/P, la longitud mínima del péptido se fijó en 7 residuos de aminoácidos, el máximo de sitios de escisión faltantes se fijó en 2 y el número máximo de cargas se fijó en 5. El error de masa máximo tolerable de el ion precursor primario se fijó en 10 ppm, y el error de masa máximo tolerable del ion producto secundario se fijó en 0,02 Da. La modificación fija se fijó en alquilación de cisteína y la modificación variable se fijó en oxidación de metionina. La puntuación del péptido fue superior a 20 puntos. También utilizamos glicodiosgenina (GDN) al 1% o CHAPS al 5% para una mejor extracción de la proteína de membrana durante la extracción de proteínas.

Los metabolitos totales se extrajeron de cada grupo utilizando aproximadamente 1 × 107 células en 1 ml de solución acuosa de MTBE (metil terc-butil éter, Sigma-Aldrich) metanol (7:2:1, v/v). Primero, se agregaron 100 μL de agua a las células lavadas para resuspenderlas. Después de mezclar, se agregaron 200 μL de solución de metanol. A continuación, las muestras se colocaron en un agitador y se agitaron durante 3 min. Luego se agregaron 700 μL de MTBE y las muestras se agitaron durante 3 min. Luego, las células se rompieron mediante ultrasonido a 4 ° C, 200 W de potencia durante 5 min. El programa se configuró en ultrasonido durante 1 sy pausa durante 2 s. Finalmente, las muestras se incubaron a 25 ℃ durante 1 h, se centrifugaron a 13 000 × g durante 15 min y luego se transfirió el sobrenadante a un tubo EP nuevo. Las muestras se secaron al vacío a 45 °C para eliminar los solventes orgánicos y luego se colocaron en un liofilizador para eliminar la humedad restante. Para la detección por LC-MS, las muestras se disolvieron con una solución acuosa de MTBE metanol (7:2:1, v/v). Las muestras se analizaron mediante LC-MS (un sistema de espectrometría de masas UPLC I-class/VION IMS QTOF, Waters). Las muestras se separaron utilizando una columna cromatográfica inversa C18 (3 μm, Durashell, Agela Technologies). La temperatura de la columna fue de 20 °C y la velocidad de flujo fue de 0,3 ml/min. La fase móvil de la composición A fue una solución acuosa de acetonitrilo de acetato de amonio 10 mM (acetonitrilo: agua = 6:4, v/v) y la B fue una solución de isopropanol de acetato de amonio acetonitrilo 10 mM (acetonitrilo: isopropanol = 1:9, v/v). ). El procedimiento de elución en gradiente fue el siguiente: 0-7 min, B se mantuvo al 30 %; 7–25 min, B cambió linealmente de 30 a 100%; 25,1-30 min, B se mantuvo al 30%. La muestra se colocó en el automuestreador a 10 °C durante todo el análisis. Para evitar la influencia causada por la fluctuación de la señal de detección del instrumento, se adoptó una secuencia aleatoria para realizar análisis continuos de la muestra. En la cola de muestras, se estableció una muestra de control de calidad cada ocho muestras experimentales para monitorear y evaluar la estabilidad del sistema y la confiabilidad de los datos experimentales. Las condiciones de espectrometría de masas se detectaron utilizando modos de iones positivos y negativos de ionización por electropulverización (ESI). Las condiciones de la fuente positiva de ESI fueron las siguientes: temperatura del calentador 300 °C; tensión de pulverización 3,0 kV; temperatura capilar 350 °C; Nivel de RF de lente S 50%; El escaneo de MS1 varía de 50 a 1500. Las condiciones de la fuente negativa ESI fueron las siguientes: temperatura del calentador 300 °C; tensión de pulverización 2,5 kV; temperatura capilar 350 °C; Nivel de RF de lente S 60%; El escaneo de MS1 varía de 50 a 1500. Las proporciones de masa a carga de moléculas de lípidos y fragmentos de lípidos se recolectaron de acuerdo con el siguiente método: se recolectaron 10 patrones de corte (exploración MS2, HCD) después de cada exploración completa. MS1 tenía una resolución de 70 000 a m/z 200 y MS2 tenía una resolución de 17 500 a m/z 200. Los datos sin procesar fueron recopilados por el software MassLynx (MassLynx 4.2, Watres) y luego Progenesis QI (Progenesis QI 2.4, Waters ), MS-DIAL (descarga gratuita en http://prime.psc.riken.jp/) y el software de análisis Unifi (Unifi 2.0, Waters) se utilizaron para la identificación dirigida y no dirigida. Los datos sin procesar de LC-MS/MS fueron para alineaciones de picos, corrección del tiempo de retención y extracción del área de picos. La alineación de la tolerancia de MS1 y MS2 se fijó en 0,001 Da y la tolerancia del tiempo de retención se fijó en 0,02 min. La identificación de estructuras de metabolitos utilizó métodos de comparación de masas precisos (< 10 ppm) y de espectro secundario para recuperar bases de datos autoconstruidas del laboratorio. Se utilizaron el software SIMCA-P (SIMCA 14.1, Umetrics) y GraphPad para las estadísticas y el análisis de datos. Se utilizó R_studio (descarga gratuita en https://www.rstudio.com/) para realizar análisis de correlación y mapeo.

Las proteínas se extrajeron en Tris 25 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM y tampón CHAPS al 3% (p/v). Las células se lisaron mediante sonicación en hielo durante 5 min (sonicación durante 3 s, apagado durante 2 s; potencia 60 W), se centrifugaron a 12 000 × g durante 15 min a 4 °C y se recogió el sobrenadante. Los lisados ​​de proteínas se cuantificaron con un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) y luego se resolvieron mediante electroforesis en gel SDS-PAGE. Se realizó SDS-PAGE en un gel de SDS-PAGE al 10 % durante 90 min a 160 V, y luego se realizó la tinción con azul de bromofenol. Las fotografías se registraron después de la decoloración con una solución de ácido acético-metanol-agua. El análisis de transferencia Western se realizó en geles SDS-PAGE no teñidos transferidos a membranas de nitrocelulosa. A continuación, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5 % en solución salina tamponada con Tris durante 1 hora a 25 ℃. Después del bloqueo, las membranas se incubaron 12 h a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo policlonal anti-SOAT1 de conejo (ABN66, Merck) y anticuerpo monoclonal anti-β-actina de conejo (6609, Proteintech). Luego, las membranas se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 hora a 25 ℃. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un sustrato de transferencia Western quimioluminiscente mejorado.

Para analizar el efecto de los compuestos dirigidos a SOAT1 en el inmunofenotipo tumoral, los tumores de los ratones 28 días después de la dosificación se tomaron, se molieron en una suspensión unicelular y se resuspendieron en un tubo de centrífuga con solución salina balanceada de Hanks (HBSS, Gibco), se centrifugó a 2000 rpm durante 4 min y se eliminó el sobrenadante. A continuación, las células se digirieron con colagenasa 2 y colagenasa 4 para eliminar el tejido conjuntivo y los componentes de colágeno. Finalmente, la población de células inmunitarias se enriqueció con un 35% de percoll. Usamos un anticuerpo anti-CD45-APC/cy7 (103,115, Biolegend), anticuerpo anti-CD11b-APC (K009928M, Solarbio), anticuerpo anti-CD3-BV510 (100,233, BD Biosciences), anticuerpo anti-CD19b-FITC (53,343 , tecnología de señalización celular), anticuerpo anti-F4/80-PE (64763S, tecnología de señalización celular), anticuerpo anti-Ly6G-Alexa fluor 700 (127 622, Biolegend), anticuerpo anti-CD8-PerPC/cy5.5 (100 733, Biolegend ), y anticuerpo anti-CD49-BV421 (740,030, BD Biosciences) para tinción. Las muestras fueron recolectadas por el citómetro de flujo BD LSR Fortessa (BD Biosciences). Luego utilizamos el software FlowJo (descarga gratuita en https://www.flowjo.com/) para analizar los datos. La estrategia de activación/secuenciación del clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) se muestra en la Figura complementaria S6.

En este estudio, la base de datos UniProt-GOA (http://www.ebi.ac.uk/GOA/) y la base de datos de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (https://www.kegg.jp/) Gene Se proporcionan anotaciones de ontología (GO) y anotaciones de vías metabólicas. Se utilizaron diagramas de volcán y de Venn para identificar y clasificar proteínas o metabolitos diferenciales. Todas las proteínas o metabolitos expresados ​​diferencialmente se importaron a R_studio para buscar vías relevantes. Los resultados de las vías se clasificaron automáticamente en categorías de rango y se consideraron significativos cuando el valor de P ajustado fue < 0,05, y un P < 0,01 se consideró muy significativo. GO analiza los procesos biológicos, los componentes celulares y las funciones moleculares de proteínas o metabolitos desregulados. Las proteínas diferenciales o los metabolitos de cada vía de señalización se marcaron utilizando el sitio web en línea KEGG, y las imágenes finales se visualizaron en Cytoscape 7.1 [18]. R_studio se utilizó para dibujar los diversos mapas de volcanes, diagramas de Venn, diagramas de dispersión y mapas de calor de correlación.

Para un análisis detallado de los resultados estadísticos, consulte cada método. Los valores de P que aparecen en este informe se calcularon mediante la prueba t de Student de dos colas. Se consideró significativo AP < 0,05 y muy significativo un P < 0,01. Se utilizó la desviación estándar relativa (RSD) para expresar la precisión de los resultados de las pruebas analíticas. Cuanto menor sea el valor, mejor será la repetibilidad. La tasa de falso descubrimiento (FDR) es el valor esperado del número de falsos rechazos, como porcentaje de todas las hipótesis rechazadas. Como índice de control para la tasa de error de la hipótesis de prueba, el valor de control se seleccionó de acuerdo con la necesidad, y el valor de la prueba de hipótesis tradicional generalmente se estableció en 0.05. En este estudio, todos los análisis bioquímicos se realizaron de forma independiente al menos tres veces. Se utilizó GraphPad Prism 8.21 para analizar los datos. Se utilizó un análisis de correlación de Pearson para medir la correlación lineal de los datos. Se usó un diagrama de volcán para mostrar los resultados del análisis de expresión diferencial, y se usó un diagrama de Venn para mostrar la conexión lógica entre diferentes grupos (conjuntos). El análisis de enriquecimiento GO y el análisis de la ruta KEGG se basan en herramientas en línea (como el mapeador y la cadena KEGG) y herramientas fuera de línea (como Cytoscape 3.7). Para otros análisis no computacionales se utilizó Microsoft Excel (Microsoft Excel 2019).

Los datos de MS de proteínas se depositaron en iProX [19] (un miembro oficial del consorcio ProteomeXchange) como un archivo adjunto (http://www.iprox.org) con el ID de proyecto IPX0003944000. Los datos de metabolómica informados en este documento se depositaron en MetaboLights [20] como un archivo adjunto (https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS4088) con el ID de proyecto MTBLS4088.

Anteriormente, descubrimos que la proteína SOAT1 está estrechamente relacionada con la supervivencia de la mayoría de los pacientes con carcinoma hepatocelular maligno, lo que promete convertirse en un objetivo potencial para la terapia del carcinoma hepatocelular [8]. En este estudio, desarrollamos una tecnología de detección de afinidad integrada de detección virtual basada en la proteína SOAT1 para descubrir rápidamente ligandos de proteínas diana. El flujo de trabajo general comenzó con la estructura cristalina de alta resolución del homodímero y tetrámero SOAT1 humano (código PDB: 6VUM y 6L47) [12, 13] (Figura S1a). La cavidad catalítica en el residuo His460 de SOAT1, que se considera que es el sitio catalítico para la síntesis de ésteres de colesterol entre colesterol y acetil-CoA, se definió como el sitio objetivo de detección. El acoplamiento molecular se implementó utilizando cuatro herramientas diferentes de ensamblaje de conjuntos (AutoDock 4.2, SYBYL 2.0 y modos de precisión estándar (SP) y precisión extra (XP) en Glide) para mejorar la precisión y la tasa de aciertos de la proyección virtual. Se utilizaron los 31 276 compuestos en las bibliotecas de la FDA y, como resultado, se identificaron como ligandos putativos 62 compuestos en total, clasificados por las cuatro herramientas de acoplamiento con una puntuación más alta que la del control positivo (Fig. 1a y tabla S1, lleno de resultados de acoplamiento que se muestran en un archivo adicional separado 1). Un análisis adicional de acoplamiento molecular de alta precisión demostró que los compuestos seleccionados (nilotinib como representante) y el compuesto cristalino de nevanimiba se unieron al bolsillo catalítico de la proteína SOAT1 (Fig. 1b).

Cribado de fármacos basado en la proteína SOAT1. un examen virtual de la proteína SOAT1 basado en la estructura arrojó 62 compuestos potenciales (en naranja). Los 200 compuestos principales se seleccionaron de los resultados de la evaluación de cada software y fueron evaluados por al menos otras tres plataformas de software. Todos los resultados se compararon con avasimiba, con una desviación estándar relativa (DER) < 15 %. b Tanto el receptor SOAT1 como el compuesto de control (nilotinib) de los compuestos examinados se unieron al sitio catalítico en comparación con el control positivo nevanimiba. c Esquema de detección de fármacos de la proteína SOAT1 mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). d SPR calculó la KD de los ligandos cocristalinos conocidos (nevanimiba) de SOAT1 para confirmar la confiabilidad del sistema. El cribado de la biblioteca de fragmentos de SPR verificó 33 resultados de cribado virtual. Entre ellos, había 10 compuestos con una unidad de respuesta (RU) > 10 (histograma naranja), incluidos tres controles positivos (estrella roja), 16 compuestos que no se unían a la proteína (histograma negro) y otros 7 compuestos tenían señal. errores (histograma gris). f El valor KD de los ligandos examinados se calculó mediante SPR

Se realizó un cribado de afinidad basado en SOAT1 para verificar los ligandos putativos de cribado virtual. El cDNA de longitud completa de SOAT1 humano (NCBI ID: 6646) se clonó en el vector pCAG con una etiqueta carboxi-terminal 6 × His (Figura S1b, c y d). La proteína se expresó en células HEK293F y, después de una serie de pasos de purificación de proteínas, se obtuvo una forma de dímero estable de proteína SOAT1 (Figura S1e yf). La proteína purificada se fijó en un chip CM5 para la detección y verificación de la afinidad mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR). El proceso general se muestra en la Fig. 1c. Primero, el análisis de los controles positivos de nevanimiba mostró que se exhibió una unión adecuada a la proteína SOAT1, lo que indicó que el sistema de detección era sólido (Fig. 1d). Luego, los 33 compuestos de mayor puntuación y fáciles de obtener (alrededor de la mitad de los 62 compuestos candidatos en el examen virtual) se identificaron más mediante el examen de la biblioteca de fragmentos SPR. De estos 33, se determinó que 10 compuestos se unían a SOAT1 (incluidos tres controles positivos: avasimiba, nevanimiba y CI-976) (Fig. 1e, columna naranja), 16 compuestos casi no se unían a la proteína SOAT1 (Fig. 1e, columna negra), y 7 compuestos no pudieron ser determinados con precisión por SPR debido a las características de las propias moléculas (Fig. 1e, columna gris). Estos resultados indicaron que a pesar de que las reglas de detección se formularon estrictamente durante el proceso de detección virtual, todavía existen falsos positivos. Finalmente, estos falsos positivos se eliminaron mediante el cribado por afinidad.

Posteriormente, determinamos aún más el valor del índice de afinidad KD de los 10 compuestos anteriores con SOAT1 a través de SPR. Los resultados mostraron que tres compuestos, nilotinib, ABT-737 y evacetrapib, exhibieron un valor KD de 2.02E-7 M, 7.19 E-7 M y 3.91 E-6 M, respectivamente (Fig. 1f). Nilotinib tuvo valores de KD más bajos para la proteína SOAT1 en comparación con los controles positivos de nevanimiba, lo que indica el potencial que tienen como fármacos dirigidos a SOAT1. En resumen, desarrollamos una estrategia de detección virtual y detección de afinidad integrada para el descubrimiento rápido y eficiente de ligandos para la proteína SOAT1 y finalmente obtuvimos tres compuestos candidatos que se dirigieron a la proteína SOAT1.

El nivel de expresión de SOAT1 se correlacionó con la tasa de supervivencia general de los pacientes con hepatocitos en nuestra proteómica y una cohorte de microarrays de tejidos (TMA) y el conjunto de datos del Cancer Genome Atlas (TCGA) [21]. Cuanto mayor sea el nivel de expresión de SOAT1, menor será la supervivencia global de los pacientes. En nuestro estudio anterior, también demostramos que la eliminación del gen SOAT1 puede inhibir significativamente el crecimiento de líneas celulares de carcinoma hepatocelular [8]. Estos resultados indicaron que los compuestos dirigidos a SOAT1 tienen el potencial de inhibir el crecimiento del carcinoma hepatocelular. Con el fin de determinar el efecto de los compuestos dirigidos a SOAT1 sobre el carcinoma hepatocelular, seleccionamos tres líneas celulares de carcinoma hepatocelular diferentes, Hep3B, HepG2 y Huh7, para las pruebas de actividad del fármaco. Los resultados de la transferencia Western mostraron que la expresión relativa de SOAT1 en las células HepG2 era mayor que la de las células Hep3B y las células Huh7 (Fig. 2a, transferencias originales sin recortar que se muestran en el archivo adicional 2). El compuesto representativo nilotinib se comparó con los controles positivos nevanimiba. Tanto los resultados de migración celular como de proliferación celular mostraron que los dos compuestos inhibieron significativamente la migración y proliferación de células de cáncer de hígado en varias concentraciones, pero nilotinib logró el efecto inhibidor en concentraciones más bajas (Fig. 2b y Figura S2a, b). La concentración inhibitoria media máxima (IC50) de los dos compuestos en las tres líneas celulares de cáncer de hígado también mostró que el valor de IC50 de nilotinib fue mucho más bajo que el de los controles positivos de nevanimiba (Fig. 2b). Además, el efecto inhibidor de los compuestos en líneas celulares con alta expresión de SOAT1 fue mejor que en líneas celulares con baja expresión de SOAT1. Esto indicó que los compuestos dirigidos a SOAT1 tienen un mejor efecto terapéutico en pacientes con alta expresión de SOAT1, lo que también es consistente con nuestros resultados anteriores. Finalmente, los resultados de los experimentos de formación de colonias y ciclo celular mostraron que nevanimiba y nilotinib pueden detener significativamente las células en la etapa temprana de síntesis de ADN y bloquearon la fase de replicación del ADN (fase G1 y fase S) (Figura S2c) e inhibieron la formación de colonias de células de carcinoma hepatocelular. (Fig. 2c, d).

Verificación de la actividad in vitro e in vivo de los compuestos identificados. a Expresión relativa de SOAT1 en diferentes líneas celulares de cáncer de hígado (n = 3). b Curvas de dosis-respuesta de líneas celulares de carcinoma hepatocelular al tratamiento con nilotinib en comparación con el control positivo (nevanimiba), con una medición del punto final a las 48 h (n = 3). c, d Ensayo de formación de colonias en células Hep3B y HepG2. El área de la colonia se analizó con el software ImageJ y se representó gráficamente con GraphPad Prism 8.21 (n = 3). Los gráficos muestran la media ± DE. e Imágenes del volumen del tumor en ratones tratados con nilotinib, sorafenib y control durante 28 días. El control positivo es sorafenib y se comparó con controles de placebo. f Curva de crecimiento tumoral de ratones con xenoinjerto tumoral tratados con nilotinib (20 mg/kg/día), sorafenib (20 mg/kg/día) y controles en los días indicados (n = 6 ratones por grupo). El círculo, el triángulo y el cuadro indican el volumen promedio de los tumores (± SEM). Los valores de p se calcularon mediante la prueba de rango logarítmico bilateral. g Tinción inmunohistoquímica de SOAT1 en tumores después de nilotinib, sorafenib y control (barra de escala = 50 μm)

Para determinar aún más el efecto terapéutico de los compuestos sobre el carcinoma hepatocelular, ampliamos la evaluación de la eficacia a un modelo de xenoinjerto de tumor murino. En primer lugar, observamos el efecto del compuesto sobre el estado fisiológico de los ratones diana (NOD-SCID). Los resultados experimentales mostraron que el tratamiento con nilotinib y el fármaco de control positivo sorafenib durante 4 semanas no tuvo ningún efecto sobre el peso corporal de los ratones con xenoinjerto (Figura S2d). Posteriormente, se inyectó nilotinib por vía intraperitoneal en ratones con xenoinjertos derivados de células HepG2 a una dosis de 20 mg/kg/día (n = 6). Se utilizó un placebo como control en blanco y el fármaco de primera línea para el tratamiento del cáncer de hígado, sorafenib, se utilizó como control positivo. La administración continuó durante 4 semanas y se observó y registró el crecimiento del tumor. Como se muestra en la Fig. 2e, después de 4 semanas de administración continua, el volumen del tumor en los grupos tratados con nilotinib fue significativamente menor que el grupo de control en blanco y comparable al grupo de control positivo. La curva de crecimiento tumoral también mostró que la tasa de crecimiento tumoral de los grupos tratados con nilotinib y el grupo de control positivo fue significativamente menor que la del grupo de control en blanco (Fig. 2f). La tinción inmunohistoquímica de SOAT1 en tumores después de la administración de los compuestos mostró que la proteína SOAT1 en los tejidos tumorales de los ratones era significativamente menor que la del grupo de control (Fig. 2g). Estos resultados no solo confirmaron que los compuestos dirigidos a SOAT1 pueden inhibir significativamente el crecimiento del carcinoma hepatocelular, sino que también indicaron que pueden tener potencial clínico como un nuevo tratamiento para el carcinoma hepatocelular.

En muchos pacientes con tumores, la síntesis y la captación de colesterol están significativamente reguladas, con una acumulación significativa de derivados del colesterol, como ésteres de colesterol y colesterol oxidado [22]. Sin embargo, el mecanismo molecular subyacente del metabolismo del colesterol en las células de cáncer de hígado aún no se comprende bien. Aquí, realizamos un análisis proteómico en la línea celular de cáncer de hígado HepG2 tratada con compuestos dirigidos a SOAT1 e intentamos aclarar la conexión entre la regulación de la homeostasis del colesterol y los tumores y el papel de las proteínas reguladoras de la homeostasis del colesterol en la tumorigénesis y el desarrollo. Con el fin de adquirir una visión completa del proteoma en las células de cáncer de hígado después del tratamiento con compuestos dirigidos a SOAT1, evaluamos simultáneamente las células HepG2 tratadas con nevanimiba y nilotinib durante 12 h para detectar cambios en las proteínas mediante espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS/ MS), y se usó DMSO al 0,1 % como control (n = 3) (Figura S3a). En general, los datos de todos los grupos fueron altamente repetibles con una tasa de repetición biológica > 95 % y el coeficiente de correlación de todas las muestras fue > 85 % (Figura S3b). En total, se cuantificaron 3960 proteínas a partir de 7307 proteínas identificadas (Figura S3c, llena de datos de proteoma que se muestran en el archivo adicional 3 por separado). Después de corregir múltiples pruebas al establecer el valor P en 0,01, la tasa de descubrimiento falso (FDR) en 0,05 y el cambio de pliegue > 2, 226 proteínas diferenciales (180 reguladas a la baja y 48 reguladas al alza) se desregularon simultáneamente en el proteoma de dos compuestos dirigidos a SOAT1 ( Figura 3a y Figura S3d). Luego, enviamos todas las proteínas expresadas diferencialmente al enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y la anotación de la ruta de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG). Los análisis GO y KEGG mostraron que las proteínas desreguladas estaban relacionadas con procesos metabólicos de esteroides o procesos metabólicos de colesterol, y las funciones moleculares correspondientes también estaban estrechamente relacionadas con la actividad del transportador de esteroles, la actividad de transferencia de lípidos, la unión de colesterol y la actividad de transferencia de colesterol (Fig. 3b) . Estos resultados indicaron que las proteínas más desreguladas generalmente estaban relacionadas con el metabolismo del colesterol. Investigaciones adicionales sobre las proteínas de la vía de señalización del metabolismo del colesterol encontraron 29 proteínas relacionadas con el metabolismo del colesterol significativamente alteradas después del tratamiento con compuestos dirigidos a SOAT1 (Tabla S2). La clasificación y el análisis de estas proteínas diferenciales mostraron que la mayoría de las proteínas relacionadas con la síntesis de colesterol en la vía de señalización del metabolismo del colesterol, como la fosfomevalonato quinasa (PMVK), lanosterol 14-alfa desmetilasa (CYP51A1), 7-deshidrocolesterol reductasa (DHCR7), lanosterol sintasa (LSS) y escualeno monooxigenasa (SQLE), se regularon significativamente a la baja. Además, las proteínas relacionadas con el transporte y la esterificación del colesterol, incluidas NPC1, SOAT1, la proteína de transferencia de fosfolípidos (PLTP) y el éster de colesterol neutro hidrolasa 1 (NCEH1), también se redujeron significativamente. Por el contrario, las proteínas relacionadas con la conversión del colesterol, como la esterol 26-hidroxilasa (CYP27A1), la esteroide 17-alfa-hidroxilasa/17,20 liasa (CYP17A), el miembro de la familia 1 de la aldo-ceto reductasa (D1AKR1D1) y la proteína translocadora (TSPO ), se regularon significativamente (Fig. 3c). La síntesis, la esterificación, el transporte (incluida la captación y el eflujo) y la conversión del colesterol son los principales procesos biológicos que mantienen la estabilidad del metabolismo del colesterol [23]. Numerosos estudios clínicos y preclínicos previos han demostrado que el tratamiento exitoso de los tumores se puede lograr al interferir con el metabolismo del colesterol de las células tumorales y las células inmunitarias [24]. Nuestro análisis de proteómica mostró que los compuestos dirigidos a SOAT1 no solo bloquean la producción de ésteres de colesterol, sino que también inhiben la síntesis y absorción de colesterol y promueven la conversión de colesterol en ácidos biliares. Por lo tanto, los compuestos dirigidos a SOAT1 restauraron sistemáticamente el metabolismo del colesterol en las células tumorales (Fig. 3d).

Cambios en las proteínas de la ruta del metabolismo del colesterol después del tratamiento farmacológico. a Los datos proteómicos se analizaron mediante gráficos de volcanes, con el eje x representando el log2 (FC) (muestra/control), y el eje y representando el valor P de − log10. Los puntos rojos indican proteínas significativamente diferentes reguladas por compuestos dirigidos a SOAT1; los puntos grises, azules y verdes indican proteínas que no tienen sentido o son datos cualitativos deficientes. Las proteínas significativas están marcadas con recuadros. b Gene Ontology (GO) analiza el proceso biológico, el componente celular y la función molecular de las proteínas desreguladas. Los valores de P se corrigieron mediante el algoritmo de Benjamini-Hochberg (BH) y se realizaron llamadas significativas en función de un valor de P ajustado por BH < 0,01. c El mapa de calor del grupo de las proteínas del metabolismo del colesterol desregulado después del tratamiento con compuestos dirigidos a SOAT1. d Información biológica sobre la reprogramación del metabolismo del colesterol después del tratamiento con compuestos dirigidos a SOAT1. La puntuación de alteración de cada proteína se representa como proporciones logarítmicas (cambio en veces, expresado como log2 (relación de la abundancia promedio de proteínas en cada tratamiento de resultados proteómicos frente al grupo de control)). Las barras de color rectangulares indican proteínas reguladas al alza y a la baja

Con el fin de aclarar aún más la conexión entre el metabolismo del colesterol y los tumores, hemos realizado una investigación sobre el metabolismo de los lípidos en las células. De manera similar a nuestro experimento de proteómica, tratamos simultáneamente las células HepG2 con dos compuestos dirigidos a SOAT1, nevanimiba y nilotinib, durante 12 h, y se utilizó DMSO al 0,1 % como control (n = 6). El método MTBE (metil terc-butil éter) informado anteriormente se utilizó para extraer metabolitos lipídicos de las células tumorales [25]. Estos metabolitos extraídos luego se enviaron a LC-MS/MS para su análisis (Figura S4a). Los resultados del análisis de correlación de Pearson se visualizaron en un mapa de calor de correlación, que representaba el paralelismo de la duplicación biológica de los datos de cada muestra (Figura S4b). En general, se cuantificaron 1890 compuestos a partir de 19 671 espectros de MS/MS identificados y se clasificaron 662 metabolitos (Figura S4c, con todos los datos del metaboloma que se muestran en el archivo adicional 4 por separado). Después de corregir múltiples pruebas al establecer el valor P en 0,01, la tasa de descubrimiento falso (FDR) en 0,05 y el cambio de pliegue> 2410 metabolitos diferenciales (239 regulados a la baja y 171 regulados al alza) se detectaron en el metaboloma de nevanimiba y nilotinib (Fig. 4a y Figura S4d). Para identificar con mayor precisión los cambios diferenciales en los metabolitos asociados con las vías del metabolismo del colesterol, realizamos un análisis de metaboloma específico utilizando estándares de metabolitos. Como resultado, encontramos que 26 metabolitos de la ruta del metabolismo del colesterol cambiaron después de la administración (Tabla S3). El análisis de grupos de mapas de calor mostró que los compuestos de hormonas de hidroxiesterol, ácido biliar y esterol estaban significativamente regulados al alza, mientras que el preesterol y el éster de colesterol estaban significativamente regulados a la baja (Fig. 4b). Específicamente, los metabolitos de hidroxisterol, ácidos biliares y hormonas esteroides, como 20-α, 22-β-dihidroxicolesterol, 24-hidroxicolesterol, ácido litocólico y pregnenolona, ​​aumentaron significativamente, mientras que los metabolitos de preesterol y éster de colesterol, como lanosterol , 4,4-dimetil-5-α-colesta-8, 14-desmetilanosterol, éster de colesterol 18:0 y éster de colesterol 20:0 se redujeron significativamente (Fig. 4c). Estos resultados confirmaron además que los compuestos dirigidos a SOAT1 pueden inhibir la síntesis, la esterificación y el transporte de colesterol, y promover la conversión de colesterol.

Cambios en los precursores de la síntesis de colesterol y derivados metabólicos tras el tratamiento farmacológico. a Los datos del metaboloma se analizaron mediante gráficos de volcanes, con el eje x representando el log2 (FC) (muestra/control) y el eje y representando el valor de P − log10. Los puntos rojos indican metabolitos significativamente diferentes regulados por el compuesto dirigido por SOAT1; los puntos grises, azules y verdes indican proteínas que no tienen sentido o son datos cualitativos deficientes. b Cambios en los metabolitos del colesterol en líneas celulares de carcinoma hepatocelular después del tratamiento con compuestos dirigidos a SOAT1. La puntuación de alteración de cada metabolito se representa como proporciones logarítmicas (veces de cambio, expresadas como log2 (proporción de abundancia de metabolitos en cada tratamiento proteómico frente al grupo de control)) (P < 0,01). c Cambios de metabolitos representativos en la vía de señalización del metabolismo del colesterol después del tratamiento con compuestos dirigidos a SOAT1 (n = 6). Los gráficos muestran la media ± DE. Los valores de p se calcularon mediante la prueba de rango logarítmico bilateral

La evidencia creciente ha sugerido que la programación del metabolismo del colesterol se asocia con un mayor riesgo de recurrencia y una mayor tasa de mortalidad en pacientes con cáncer de hígado [26]. Con el fin de explorar la relación entre las proteínas de la ruta del metabolismo del colesterol afectadas por los compuestos dirigidos a SOAT1 identificados y la supervivencia de los pacientes con cáncer de hígado, comparamos y analizamos retrospectivamente los datos del proteoma de pacientes clínicos con cáncer de hígado en el Proyecto del Proteoma Humano Chino (CNHPP) (http://liver.cnhpp.ncpsb.org/), datos de transcriptoma de pacientes con cáncer de hígado de TCGA (https://www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Cancer-Genome-Atlas) y nuestros datos de proteoma generado en este estudio. Estos datos indicaron que las proteínas de la ruta del metabolismo del colesterol mencionadas anteriormente reguladas por compuestos dirigidos a SOAT1 se expresan de manera opuesta a los datos del proteoma autólogo y los datos del transcriptoma de pacientes con cáncer de hígado, lo que indica que la regulación del metabolismo del colesterol se revertiría y restauraría en pacientes con cáncer de hígado después del tratamiento con Fármacos dirigidos a SOAT1 (Fig. 5a). Luego, analizamos la información de seguimiento de la supervivencia de estos pacientes (se muestra en el archivo adicional 5 por separado), y descubrimos que estas proteínas reguladoras del metabolismo del colesterol están realmente relacionadas con la supervivencia de los pacientes con cáncer de hígado. La alta expresión de proteínas relacionadas con la síntesis de colesterol y las proteínas relacionadas con la esterificación del colesterol no favorecen la supervivencia de los pacientes con cáncer de hígado, mientras que la alta expresión de proteínas relacionadas con la conversión del colesterol favorece la supervivencia de los pacientes con cáncer de hígado (Fig. 5b y Figura S5). Estos resultados indicaron que los compuestos dirigidos a SOAT1 restauran el metabolismo del colesterol y son un tratamiento prometedor para promover la supervivencia de los pacientes con cáncer de hígado.

Análisis de asociación de proteómica de fármacos y datos clínicos de pacientes con cáncer de hígado. a Análisis comparativo del proteoma del fármaco y el proteoma del paciente con cáncer de hígado clínico y los datos del transcriptoma del paciente con cáncer de hígado del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA). b La relación entre las proteínas de desregulación del colesterol reguladas por fármacos y la supervivencia de los pacientes con cáncer de hígado

Un estudio anterior mostró que la inhibición de la esterificación del colesterol en las células T mediante la ablación genética o la inhibición farmacológica de SOAT1 mejoró significativamente la respuesta antitumoral de las células T CD8+ en ratones [10, 11]. El aumento de los niveles de colesterol en la membrana plasmática de las células T CD8+ conduce a la acumulación de receptores de células T y a una mayor transducción de señales, así como a una formación más eficaz de sinapsis inmunitarias [27]. Para comprender mejor la relación entre los inhibidores de SOAT1 y las poblaciones de células inmunitarias y sus efectos sobre los tumores, utilizamos citometría de flujo multicolor para detectar cambios en las poblaciones de células inmunitarias después de la administración de compuestos dirigidos a SOAT1 en un modelo de xenoinjerto de células murinas Hepa1-6. Trasplantamos células Hepa1-6 en ratones inmunocompetentes (C57BL/6 J) para construir un nuevo modelo de análisis de xenoinjerto tumoral. Después del tratamiento con nilotinib y el fármaco de control positivo sorafenib durante 4 semanas a una dosis de 20 mg/kg/día (n = 6), se recolectaron los tumores y se analizaron los cambios en la población de células inmunitarias. Como se muestra en la Fig. 6a y la Figura S6a, en ratones modelo de xenoinjerto tumoral con inmunidad, los compuestos dirigidos a SOAT1 tuvieron efectos supresores de tumores significativos. Incluso 2 semanas después de la administración, el tamaño del tumor había disminuido. Inmediatamente después, eliminamos estos tumores y realizamos un análisis de citometría de flujo multicolor de acuerdo con el método descrito anteriormente [28, 29]. Para etiquetar los diferentes tipos de células. Según los resultados experimentales, la distribución de las poblaciones de células tumorales en ratones cambió significativamente después de la administración (Fig. 6b). Específicamente, después del tratamiento farmacológico, el porcentaje de células marcadas con CD3+ + CD8+ y células marcadas con CD11b+ + Ly6G+ aumentó significativamente en el número total de células leucocitarias marcadas con CD45, mientras que el porcentaje de células marcadas con CD3+ + CD49+ y células marcadas con CD11+ + F4/80+ fue mayor. relativamente reducido (Fig. 6c, d). En particular, en comparación con un informe anterior [10], no solo la proporción de células T marcadas con CD3+ + CD8+, sino también la de neutrófilos marcados con CD11b+ + Ly6G+ en tejidos tumorales de ratones tratados con nilotinib y sorafenib aumentó significativamente (Fig. 6e, f). Estos resultados indicaron que los compuestos dirigidos a SOAT1 que identificamos también pueden potenciar los efectos antitumorales de las células inmunitarias.

Verificación de la actividad in vitro e in vivo de los compuestos identificados. a Curva de crecimiento tumoral de xenoinjertos tumorales en ratones C57BL/6 J tratados con nilotinib (20 mg/kg/día), sorafenib (20 mg/kg/día) y controles en los días indicados (n = 6 ratones por grupo). El círculo, el triángulo y el recuadro indican el volumen promedio de los tumores (± SEM), y los valores de P se calcularon mediante la prueba de rango logarítmico bilateral. b Activación basada en tipos de células marcadas con diferentes anticuerpos de citometría de flujo. SSC-A significa granularidad celular, leucocitos marcados con CD45, células T citotóxicas marcadas con CD3+ y CD8+, células NK marcadas con CD3+ y CD49+, macrófagos marcados con CD11b+ y F4/80+, neutrófilos marcados con CD11b+ y Ly6G+. c, d Producción de citoquinas de xenoinjerto tumoral estimulado de células murinas CD8+, CD49+, F4/80+ y Ly6G+ pretratadas con nilotinib, sorafenib o DMSO (n = 6). e, f Porcentaje de cantidad relativa media SD de células CD3+ + CD8+, CD3+ + CD49+, CD11b+ + F4/80+ y CD11b+ + Ly6G+ pretratadas con nilotinib, sorafenib o DMSO (n = 6). Los valores de p se calcularon mediante la prueba de rango logarítmico bilateral

Estudios previos han informado que el colesterol y sus metabolitos juegan un papel importante en el cáncer [30, 31]. Estudios preclínicos recientes han demostrado que el bloqueo de la síntesis y la captación de colesterol tiene un efecto inhibidor sobre la formación y el crecimiento de tumores [32]. En este estudio, establecimos una tecnología de detección de alto rendimiento basada en interacciones proteína-ligando diana a través de la integración de tecnología de detección virtual y detección por afinidad. Tres compuestos, nilotinib, ABT-737 y evacetrapib, mostraron una unión óptima con SOAT1. En particular, nilotinib mostró una alta afinidad por la proteína SOAT1 e inhibió significativamente la actividad tumoral tanto in vitro como in vivo, lo que destaca su potencial clínico en el tratamiento del cáncer de hígado. Los estudios de proteoma y metabolismo demostraron que los compuestos dirigidos a la proteína SOAT1 no solo bloquean directamente la conversión del colesterol en ésteres de colesterol al inhibir la actividad de la proteína SOAT1, sino que también reprograman el metabolismo del colesterol. Para ser precisos, se inhibe la síntesis de colesterol, se bloquea el transporte (incluida la ingesta y el eflujo) y se activa la conversión (derivatización de ácidos biliares, hidroxicolesterol y hormonas esteroles). Varios estudios han confirmado que los cambios en estas sustancias tienen un efecto inhibidor sobre las células tumorales, incluida la mejora del microambiente inmunitario, como las células T y los neutrófilos (Fig. 7). También se ha informado que los cambios en estas proteínas de la ruta de señalización del metabolismo del colesterol están relacionados con la supervivencia de los pacientes con cáncer de hígado. En general, no solo establecimos una tecnología de detección de alto rendimiento basada en la proteína SOAT1 y obtuvimos inicialmente dos candidatos prometedores para el tratamiento del cáncer de hígado, sino que también revelamos sistemáticamente que los compuestos dirigidos a SOAT1 reprograman el metabolismo del colesterol para remediar el carcinoma hepatocelular.

Mecanismo antitumoral de compuestos dirigidos a SOAT1. Los compuestos que se dirigen a la proteína SOAT1 reprograman el metabolismo del colesterol tumoral, bloqueando específicamente la producción de éster de colesterol, inhibiendo la síntesis y el transporte de colesterol y activando la conversión. Estos compuestos también mejoran simultáneamente las células inmunitarias para inhibir el crecimiento tumoral.

La detección de fármacos antitumorales que se dirigen a la programación del metabolismo del colesterol es un área popular de investigación, y algunos fármacos objetivo se están promoviendo actualmente para investigación clínica o preclínica [3, 4]. Varios fármacos, como HMGCR, MVK, LDLR y FDPS, han progresado significativamente en el desarrollo de fármacos, pero la mayoría de los fármacos aún se encuentran en fases clínicas o preclínicas de investigación [33, 34]. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas que puedan convertirse en nuevos fármacos eficaces y tolerables para pacientes con carcinoma hepatocelular avanzado es un trabajo continuo a largo plazo [35, 36]. En este estudio, establecimos una detección de drogas de alto rendimiento basada en objetivos basada en la proteína SOAT1 que utiliza tecnología de detección virtual y detección de afinidad integrada. Al aplicar esta estrategia, no solo hemos logrado identificar ligandos de proteína SOAT1 de decenas de miles de compuestos (Fig. 1). Identificamos nilotinib como compuestos dirigidos a SOAT1, y además demostramos a través de varios experimentos que estos compuestos tienen una alta afinidad con la proteína SOAT1 e inhiben significativamente la actividad tumoral in vitro e in vivo (Fig. 2). Nuestra investigación no solo estableció una tecnología de cribado de proteína-ligando diana rápida y eficiente, sino que también obtuvo fármacos candidatos efectivos para la terapia dirigida del carcinoma hepatocelular. Este estudio proporcionó nuevos conocimientos para el tratamiento preciso del carcinoma hepatocelular.

La reprogramación metabólica de las células tumorales se considera una de las 10 características de los tumores, y se ha demostrado que la reprogramación metabólica del colesterol de las células tumorales desempeña un papel importante en la tumorigénesis [37]. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo subyacente de la reprogramación del metabolismo del colesterol en las células tumorales y los fármacos que se dirigen a la reprogramación metabólica del colesterol en los tumores [26, 38]. En este estudio, aplicamos análisis proteómicos y metabolómicos integrados para explorar los efectos de los compuestos dirigidos a SOAT1 en las vías de señalización del metabolismo del colesterol en las células tumorales. Descubrimos que los compuestos dirigidos a SOAT1 no solo inhibían directamente la esterificación del colesterol, sino que también inhibían la síntesis y el transporte de colesterol y promovían la conversión de colesterol (Figs. 3 y 4). Además, el análisis combinado con las ómicas de pacientes clínicos demostró que la activación o la inhibición de proteínas de colesterol específicas están estrechamente relacionadas con la supervivencia de los pacientes con carcinoma hepatocelular, y los fármacos dirigidos a SOAT1 facilitarían positivamente la supervivencia de los pacientes (fig. 5). Estos resultados revelaron sistemáticamente la conexión interna entre la programación metabólica del colesterol y los tumores; específicamente, los fármacos dirigidos a SOAT1 reducen la síntesis, la esterificación y el transporte de colesterol en las células tumorales. Se ha demostrado que mejorar la transformación del colesterol en las células tumorales es beneficioso para inhibir el crecimiento de las células tumorales.

Además, estudios recientes han demostrado que los inhibidores de la colesterol esterasa también pueden mejorar el efecto antitumoral de las células T modificadas con receptor de antígeno quimérico humano [39]. Estos estudios indican que el metabolismo del colesterol también juega un papel importante en la activación de la función antitumoral de las células inmunitarias. En este estudio, realizamos un inmunoensayo de citometría de flujo multicolor en un modelo CDX de ratón inmunocompetente y descubrimos que la cantidad relativa de células T CD8+ y neutrófilos aumentó significativamente en ratones con tumores después de tratar dos compuestos dirigidos a SOAT1. Además, después del tratamiento con dos compuestos dirigidos a SOAT1, el crecimiento tumoral en ratones no solo se inhibió, sino que también disminuyó el tamaño del tumor después de 2 semanas de dosificación (Fig. 6). Estos estudios confirmaron que el metabolismo del colesterol puede desempeñar un papel importante en la activación de las funciones antitumorales de las células inmunitarias.

En resumen, examinamos nilotinib, un ligando de alta afinidad dirigido al potencial objetivo antitumoral SOAT1. En comparación con los inhibidores conocidos, tiene una mayor afinidad por SOAT1 y un mejor efecto inhibidor. Más importante aún, como fármaco actualmente en uso clínico, el nilotinib puede tener un mejor efecto antitumoral al atacar simultáneamente las células tumorales y el microambiente inmunitario al reprogramar el metabolismo del colesterol intracelular de las células tumorales y mejorar las células T CD8+ y los neutrófilos. Se espera que se utilice para la terapia dirigida y la inmunoterapia combinada en pacientes con carcinoma hepatocelular SOAT1 alto.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Xenoinjerto derivado de células

Los medios de Eagle modificados de Dulbecco

Ionización por electropulverización

Suero bovino fetal

Ontología de genes

3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa

Concentración inhibitoria media máxima

Constante de disociación de equilibrio

Enciclopedia de Kioto de Genes y Genomas

Espectrómetro de masas para cromatografía líquida

Receptor X hepático

Metil terc-butil éter

Transportador de colesterol intracelular NPC 1

Yoduro de propidio

Esterol O-aciltransferasa 1

Goossens P, Rodriguez-Vita J, Etzerodt A, Masse M, Rastoin O, Gouirand V, Ulas T, Papantonopoulou O, Van Eck M, Auphan-Anezin N, et al. El flujo de salida de colesterol de la membrana impulsa la reprogramación de macrófagos asociados con el tumor y la progresión del tumor. Metab. celular 2019;29(6):1376–89 (e1374).

Artículo CAS Google Académico

Riscal R, Skuli N, Simon MC. ¡Incluso las células cancerosas vigilan su colesterol! Célula Mol. 2019;76(2):220–31.

Artículo CAS Google Académico

Huang B, Song BL, Xu C. Metabolismo del colesterol en el cáncer: mecanismos y oportunidades terapéuticas. Nat Metab. 2020;2(2):132–41.

Artículo Google Académico

Zhang H, Zhao W, Li X, He Y. El metabolismo del colesterol como objetivo terapéutico potencial y biomarcador pronóstico para la inmunoterapia contra el cáncer. Objetivos Onco Ther. 2021;14:3803–12.

Artículo Google Académico

Yarmolinsky J, Bull CJ, Vincent EE, Robinson J, Walther A, Smith GD, Lewis SJ, Relton CL, Martin RM. Asociación entre la inhibición genética de la HMG-CoA reductasa y el cáncer de ovario epitelial. JAMA. 2020;323(7):646–55.

Artículo CAS Google Académico

Head SA, Shi WQ, Yang EJ, Nacev BA, Hong SY, Pasunooti KK, Li RJ, Shim JS, Liu JO. La orientación simultánea de NPC1 y VDAC1 por itraconazol conduce a la inhibición sinérgica de la señalización de mTOR y la angiogénesis. ACS Chem Biol. 2017;12(1):174–82.

Artículo CAS Google Académico

Wan W, Hou Y, Wang K, Cheng Y, Pu X, Ye X. El ARN no codificante largo LINC01125 inducido por LXR-623 suprime la proliferación de células de cáncer de mama a través de la vía de señalización PTEN/AKT/p53. Enfermedad de muerte celular. 2019;10(3):248.

Artículo Google Académico

Jiang Y, Sun A, Zhao Y, Ying W, Sun H, Yang X, Xing B, Sun W, Ren L, Hu B, et al. La proteómica identifica nuevas dianas terapéuticas del carcinoma hepatocelular en estadio temprano. Naturaleza. 2019;567(7747):257–61.

Artículo CAS Google Académico

Yue S, Li J, Lee SY, Lee HJ, Shao T, Song B, Cheng L, Masterson TA, Liu X, Ratliff TL, et al. La acumulación de éster de colesterol inducida por la pérdida de PTEN y la activación de PI3K/AKT subyace a la agresividad del cáncer de próstata humano. Metab. celular 2014;19(3):393–406.

Artículo CAS Google Académico

Ma X, Bi E, Lu Y, Su P, Huang C, Liu L, Wang Q, Yang M, Kalady MF, Qian J, et al. El colesterol induce el agotamiento de las células T CD8(+) en el microambiente tumoral. Metab. celular 2019;30(1):143–56 (e145).

Artículo CAS Google Académico

Yang W, Bai Y, Xiong Y, Zhang J, Chen S, Zheng X, Meng X, Li L, Wang J, Xu C, et al. Potenciación de la respuesta antitumoral de las células T CD8(+) mediante la modulación del metabolismo del colesterol. Naturaleza. 2016;531(7596):651–5.

Artículo CAS Google Académico

Long T, Sun Y, Hassan A, Qi X, Li X. Estructura de la ACAT1 humana tetramérica unida a nevanimiba. Naturaleza. 2020;581(7808):339–43.

Artículo CAS Google Académico

Guan C, Niu Y, Chen SC, Kang Y, Wu JX, Nishi K, Chang CCY, Chang TY, Luo T, Chen L. Información estructural sobre el mecanismo de inhibición de la esterol O-aciltransferasa 1 humana por un inhibidor competitivo. Nat Comun. 2020;11(1):2478.

Artículo CAS Google Académico

Santos-Martins D, Forli S, Ramos MJ, Olson AJ. AutoDock4(Zn): un campo de fuerza AutoDock mejorado para el acoplamiento de moléculas pequeñas a metaloproteínas de zinc. Modelo J Chem Inf. 2014;54(8):2371–9.

Artículo CAS Google Académico

Homer RW, Swanson J, Jilek RJ, Hurst T, Clark RD. Notación de línea SYBYL (SLN): una notación única para representar estructuras químicas, consultas, reacciones y bibliotecas virtuales. Modelo J Chem Inf. 2008;48(12):2294–307.

Artículo CAS Google Académico

Halgren TA, Murphy RB, Friesner RA, Beard HS, Frye LL, Pollard WT, Banks JL. Glide: un nuevo enfoque para acoplamiento y puntuación rápidos y precisos. 2. Factores de enriquecimiento en la selección de bases de datos. J Med Chem. 2004;47(7):1750–9.

Artículo CAS Google Académico

Schiffrin B, Radford SE, Brockwell DJ, Calabrese AN. PyXlinkViewer: una herramienta flexible para la visualización de datos de reticulación química de proteínas dentro del sistema de gráficos moleculares PyMOL. Ciencia de las proteínas 2020;29(8):1851–7.

Artículo CAS Google Académico

Shannon P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D, Amin N, Schwikowski B, Ideker T. Cytoscape: un entorno de software para modelos integrados de redes de interacción biomolecular. Genoma Res. 2003;13(11):2498–504.

Artículo CAS Google Académico

Chen T, Ma J, Liu Y, Chen Z, Xiao N, Lu Y, Fu Y, Yang C, Li M, Wu S, et al. iProX en 2021: conectando el intercambio de datos proteómicos con big data. Ácidos Nucleicos Res. 2022;50(D1):D1522–7.

Artículo CAS Google Académico

Haug K, Cochrane K, Nainala VC, Williams M, Chang J, Jayaseelan KV, O'Donovan C. MetaboLights: un recurso que evoluciona en respuesta a las necesidades de su comunidad científica. Ácidos Nucleicos Res. 2020;48(D1):D440–4.

CAS PubMed Google Académico

Red de Investigación del Atlas del Genoma del Cáncer. Dirección electrónica wbe, Cancer Genome Atlas Research N: Caracterización genómica completa e integradora del carcinoma hepatocelular. Celúla. 2017;169(7):1327–41 (e1323).

Artículo Google Académico

Sharpe LJ, Cook EC, Zelcer N, Brown AJ. Los altibajos de la homeostasis del colesterol. Tendencias Biochem Sci. 2014;39(11):527–35.

Artículo CAS Google Académico

Luo J, Yang H, Canción BL. Mecanismos y regulación de la homeostasis del colesterol. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(4):225–45.

Artículo CAS Google Académico

Broadfield LA, Pane AA, Talebi A, Swinnen JV, Fendt SM. Metabolismo de los lípidos en el cáncer: nuevas perspectivas y mecanismos emergentes. Célula de desarrollo. 2021;56(10):1363–93.

Artículo CAS Google Académico

Bogl T, Mlynek F, Himmelsbach M, Buchberger W. Comparación de métodos de extracción de una y dos fases para la lipidómica de tejido porcino aplicando un flujo de trabajo de anotación tentativa rápida y confiable. Talanta. 2022;236:122849.

Artículo Google Académico

Snaebjornsson MT, Janaki-Raman S, Schulze A. Engrasando las ruedas de la máquina del cáncer: el papel del metabolismo de los lípidos en el cáncer. Metab. celular 2020;31(1):62–76.

Artículo CAS Google Académico

Zhao L, Liu Y, Zhao F, Jin Y, Feng J, Geng R, Sun J, Kang L, Yu L, Wei Y. La inhibición de la enzima de esterificación del colesterol aumenta la potencia de las células T del receptor de antígeno quimérico humano contra el carcinoma pancreático. Mol Ther Oncolíticos. 2020;16:262–71.

Artículo CAS Google Académico

Flores-Montero J, Kalina T, Corral-Mateos A, Sanoja-Flores L, Perez-Andres M, Martin-Ayuso M, Sedek L, Rejlova K, Mayado A, Fernandez P, et al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Methods. 2019;475: 112618.

Artículo CAS Google Académico

Almeida AS, Fein MR, Egeblad M. Citometría de flujo multicolor para el análisis integral del infiltrado inmune tumoral en un modelo murino de cáncer de mama. Bioprotocolo 2021;11(11):e4012.

Artículo CAS Google Académico

Sica A, Bleve A, Garassino MC. El colesterol de membrana regula la plasticidad de los macrófagos en el cáncer. Metab. celular 2019;29(6):1238–40.

Artículo CAS Google Académico

Bovenga F, Sabba C, Moschetta A. Desacoplamiento del receptor nuclear LXR y el metabolismo del colesterol en el cáncer. Metab. celular 2015;21(4):517–26.

Artículo CAS Google Académico

Waku T, Hagiwara T, Tamura N, Atsumi Y, Urano Y, Suzuki M, Iwami T, Sato K, Yamamoto M, Noguchi N, et al. NRF3 aumenta la expresión génica en la vía de mevalonato dependiente de SREBP2 con inhibición de la captación de colesterol y la lipogénesis. iCiencia. 2021;24(10):1

Artículo CAS Google Académico

Xu H, Zhou S, Tang Q, Xia H, Bi F. Metabolismo del colesterol: nuevas funciones y enfoques terapéuticos en el cáncer. Biochim Biophys Acta Rev Cáncer. 2020;1874(1):188394.

Artículo CAS Google Académico

Gabitova L, Gorin A, Astsaturov I. Vías moleculares: esteroles y señalización de receptores en el cáncer. Clin Cáncer Res. 2014;20(1):28–34.

Artículo CAS Google Académico

Qian H, Wu X, Du X, Yao X, Zhao X, Lee J, Yang H, Yan N. Base estructural de la salida de colesterol lisosomal dependiente de pH bajo por NPC1 y NPC2. Celúla. 2020;182(1):98–111 (e118).

Artículo CAS Google Académico

Ikonomopoulou MP, Lopez-Mancheno Y, Novelle MG, Martinez-Una M, Gangoda L, Pal M, Costa-Machado LF, Fernandez-Marcos PJ, Ramm GA, Fernandez-Rojo MA. LXR estimula un cambio metabólico y revela la homeostasis del colesterol como un objetivo de estatina en la enfermedad tumoral facial del demonio de Tasmania. Representante celular 2021;34(11):108851.

Artículo CAS Google Académico

Hanahan D, Weinberg RA. Características del cáncer: la próxima generación. Celúla. 2011;144(5):646–74.

Artículo CAS Google Académico

Chan LK, Ho DW, Kam CS, Chiu EY, Lo IL, Yau DT, Cheung ET, Tang CN, Tang VW, Lee TK, et al. Las mutaciones que inactivan RSK2 potencian la señalización de MAPK y apoyan el metabolismo del colesterol en el carcinoma hepatocelular. J Hepatol. 2021;74(2):360–71.

Artículo CAS Google Académico

Li M, Yang Y, Wei J, Cun X, Lu Z, Qiu Y, Zhang Z, He Q. Quimioinmunoterapia mejorada contra el melanoma mediante la inhibición de la esterificación del colesterol en las células T CD8 (+). Nanomedicina. 2018;14(8):2541–50.

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Los autores agradecen al Centro Nacional de Ciencias de Proteínas (Beijing) por su apoyo técnico en nuestro análisis de proteoma y metaboloma.

Esta investigación fue financiada por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2020YFE0202200 y 2021YFA1301603), el Fondo de Innovación de Ciencias Médicas de la Academia China de Ciencias Médicas (2019-I2M-5–063), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2021MD703973), The National Natural Fundación de Ciencias de China (32088101 y 82102804) y Programa de Proyecto Abierto del Laboratorio Estatal de Proteómica Clave (SKLP-K201903).

Laboratorio Estatal Clave de Proteómica, Centro Nacional de Ciencias de Proteínas (Beijing), Centro de Investigación de Proteomas de Beijing, Instituto de Lifeómica de Beijing, Beijing, 102206, China

Zhihua Wang, Mengxin Zhang, Kaikun Xu, Xinshuai Zhang, Yi Xie, Yiming Zhang, Cheng Chang, Aihua Sun y Fuchu He

Unidad de Investigación de Proteómica Dirven Cancer Precision Medicine, Academia China de Ciencias Médicas, Beijing, 102206, China

Zhihua Wang, Aihua Sun y Fuchu He

Primera Universidad Médica de Shandong, el primer hospital afiliado de la Primera Universidad Médica de Shandong, Jinan, 250014, China

Miaomiao Wang y Xiaolu Li

Departamento de Farmacología y Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Medicina, Universidad de Tsinghua, Beijing, 100083, China

Yi Xie

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FC.H, AH.S, XL.L y ZH.W. diseñó el estudio. ZH.W. realizaron experimentos y adquirieron y analizaron datos. MM.W, MX.Z, HM.K y YM.Z ayudaron con experimentos con células y animales. KK.X, YX y XS.Z ayudaron con el análisis bioinformático. ZH.W, CC, AH.S y FC.H analizaron e interpretaron los datos. FC.H, AH.S y XL.L contribuyeron a completar la revisión y envío del artículo. Todos los autores aprobaron el contenido del manuscrito.

Correspondencia a Xiaolu Li, Aihua Sun o Fuchu He.

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Nacional de Ciencias de Proteínas (Beijing), Número de revisión ética: IACUC-20210914-32MT.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Esquema del cribado virtual basado en SOAT1 y expresión y purificación de la proteína SOAT1. ( a ) El flujo de trabajo general de la detección virtual basada en la proteína SOAT1. ( b, c, d ) Construcción de plásmido de vector de expresión de proteína SOAT1 y análisis de digestión con enzimas de restricción. ( e ) Purificación por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de la proteína SOAT1. ( f ) Análisis SDS-PAGE de la proteína SOAT1. Los resultados mostraron que todas las proteínas SOAT1 purificadas se encontraban en un estado de dímero estable con una pureza superior al 95 %. Figura S2. Validación de la actividad biológica de compuestos dirigidos a la proteína SOAT1. (a) Un ensayo Transwell mostró que el número de células disminuyó después de la administración con diferentes compuestos dirigidos a SOAT1 (aumento original 100x). (b) Los compuestos dirigidos a SOAT1 inhibieron significativamente la proliferación de líneas celulares de cáncer de hígado. (c) Se usó tinción con PI para investigar el efecto de los ligandos en el ciclo celular: fase G0/G1 (pico azul), fase S (pico amarillo) y fase G2 (pico verde). Células acumuladas en la fase G0/G1 (n = 3). (d) Peso corporal de modelos de xenoinjertos no derivados de células tratados con sorafenib (20 mg/kg/día) o nilotinib (20 mg/kg/día) en los días indicados (n = 6 ratones por grupo). Se representa la media (± DE) del peso corporal. Figura S3. Preparación proteómica de muestras y análisis de datos. (a) Flujo de trabajo de preparación de muestras de proteoma y recopilación de datos. ( b ) Gráficos de dispersión y coeficientes de correlación de Pearson para replicar el perfil del proteoma de dos compuestos dirigidos a SOAT1 (nevanimiba y nilotinib). Los ejes x e y representan las intensidades de proteína en cada comparación por pares. En particular, los experimentos repetidos con las mismas muestras tienen una buena reproducibilidad, con un alto nivel de correlación (promedio > 0,9; rango, 0,85–1). (c) Cobertura de proteínas identificadas y cuantificadas. En total, se cuantificaron 3960 proteínas de 7307 proteínas identificadas. ( d ) Diagrama UpSet Venn de cada comparación por pares. 226 proteínas diferenciales (180 reguladas a la baja y 48 reguladas al alza) se desregularon simultáneamente en el proteoma de nevanimiba y nilotinib (n=3, p<0,01). Figura S4. Preparación de muestras de metabolomas y análisis de datos. (a) Flujo de trabajo de preparación de muestras de metaboloma y recopilación de datos. ( b ) Gráficos de dispersión y coeficientes de correlación de Pearson para replicar el perfil del metaboloma de dos compuestos dirigidos a SOAT1 (nevanimiba y nilotinib). Los ejes x e y representan las intensidades del metaboloma en cada comparación por pares. En particular, los experimentos repetidos con las mismas muestras tienen una buena reproducibilidad, con un alto nivel de correlación (promedio > 0,9; rango, 0,85–1). (c) Cobertura de picos espectrales de masas detectados y espectrales de masas cuantitativos y cualitativos. En total, se cuantificaron 1890 compuestos a partir de 19 671 espectros MS/MS identificados y se clasificaron 662 metabolitos. ( d ) Diagrama UpSet Venn de cada comparación por pares. Se detectaron 410 metabolitos diferenciales (239 regulados negativamente y 171 regulados positivamente) en el metaboloma de nevanimiba y nilotinib (n=6, p<0,01). Figura S5. La relación entre las proteínas de desregulación del colesterol reguladas por fármacos y la supervivencia de los pacientes con cáncer de hígado. Figura S6. Esquema del análisis de citometría de flujo multicolor. (a) Diagrama esquemático de un modelo de xenoinjerto derivado de células Hepa1-6 trasplantadas en ratones C57BL/6. ( b ) Análisis de citometría de flujo multicolor de modelos de xenoinjertos derivados de células. (c) Las superposiciones de histogramas muestran cambios en los perfiles de expresión entre muestras. La tabla muestra los grupos y los recuentos de células. ( d ) Mapa de calor de análisis de correlación de fluorescencia de cada color. Las células marcadas con cada anticuerpo fluorescente se distinguen claramente, lo que indica que el sistema de análisis es sólido. Tabla S1. Cuatro exámenes de acoplamiento de molecar de software produjeron 62 compuestos potenciales. Tabla S2. 29 proteínas de la ruta de señal del metabolismo del colesterol cambiaron después de la administración. Tabla S3. Targeting identificó 26 metabolitos de la vía de señalización del metabolismo del colesterol que cambiaron después de la administración.

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Reimpresiones y permisos

Wang, Z., Wang, M., Zhang, M. et al. Los ligandos SOAT1 de alta afinidad remodelaron el programa de metabolismo del colesterol para inhibir el crecimiento tumoral. BMC Med 20, 292 (2022). https://doi.org/10.1186/s12916-022-02436-8

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Recibido: 07 marzo 2022

Aceptado: 13 junio 2022

Publicado: 09 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02436-8

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