Estudios moleculares e in vivo de un glutamato

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4446 (2022) Citar este artículo

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La digestión del gluten genera péptidos tóxicos, entre los que destaca un 33-mer rico en prolina altamente inmunogénico procedente de la α-gliadina de trigo, que desencadena la enfermedad celíaca. La neprosina de la planta de jarra es una prolil endopeptidasa reportada. Aquí, producimos neprosina recombinante y sus mutantes, y descubrimos que la neprosina de longitud completa es un zimógeno, que se autoactiva a pH gástrico mediante la liberación de un prodominio all-β a través de un mecanismo de cambio de pH que presenta un tapón de lisina. . El dominio catalítico es un sándwich β atípico de 7+8 hebras con una hendidura de sitio activo extendida que contiene un par de glutamatos catalíticos sin precedentes. La neprosina degrada de forma eficiente tanto la gliadina como el 33-mero in vitro en condiciones gástricas y se inactiva de forma reversible a pH > 5. Además, la administración conjunta de gliadina y el zimógeno de neprosina en una proporción de 500:1 reduce la abundancia del 33-mero en el intestino delgado de ratones hasta en un 90%. La neprosina por lo tanto funda una familia de glutamato endopeptidasas eucariotas que cumple los requisitos para una glutamato terapéutica.

La enfermedad celíaca (CoD) es una enteropatía autoinmune crónica que afecta a individuos con sensibilización genética y ambiental al gluten dietético, un grupo de proteínas de almacenamiento de prolamina de cereales ricas en prolina y glutamina1,2. Las prolaminas que desencadenan CoD incluyen gliadina y glutenina en el trigo, hordeína en la cebada y secalina en el centeno. Se puede causar daño intestinal con tan solo ~10 mg de gluten en la dieta por día3, que es <0,1 % de la cantidad que se encuentra en una dieta occidental típica2. La CoD es una carga sanitaria mundial en todos los rangos de edad, con una prevalencia serológica mundial del 1,4 %4 que aumenta un 7,5 % cada año5. La enfermedad es causada por péptidos de gluten parcialmente degradados, incluido un fragmento de 33 residuos de α-gliadina de trigo (33-mer) que es inmunogénicamente el más relevante2,6. Estos péptidos resisten una mayor escisión por parte de las peptidasas de membrana del borde en cepillo gástricas, pancreáticas e intestinales debido a su alto contenido de prolina (13 en el 33-mer). En los celíacos, atraviesan el epitelio de la mucosa del intestino delgado, donde los residuos de glutamina son desamidados por la transglutaminasa tisular. Esto aumenta la afinidad de los péptidos por los alelos DQ2.5/DQ2.2 y DQ8 del receptor del antígeno leucocitario humano (HLA), que son necesarios para el desarrollo de CoD2. La unión al receptor desencadena una respuesta autoinmune proinflamatoria grave mediada por células T, con efectos intestinales que incluyen linfocitosis intraepitelial, hiperplasia de las criptas, atrofia de las vellosidades del intestino delgado e inflamación de la mucosa2. Estos conducen a la malabsorción crónica de nutrientes, diarrea, vómitos, distensión abdominal, dolor abdominal y linfomas intestinales. Las manifestaciones extraintestinales incluyen pubertad retrasada, osteoporosis, neuropatía axonal y ataxia cerebelosa7, que reducen la esperanza de vida de los celíacos. No existe tratamiento para la CoD, por lo que los pacientes deben seguir una dieta estricta sin gluten de por vida, que restablece la arquitectura normal de las vellosidades intestinales2. Sin embargo, las dietas sin gluten no proporcionan una nutrición equilibrada7, y muchos celíacos sufren síntomas intestinales incluso con el cumplimiento de dichas restricciones dietéticas8,9. Además, el gluten se encuentra en la mayoría de los alimentos y medicamentos procesados, lo que dificulta el cumplimiento de la dieta en las sociedades occidentales2. Esto ha creado una demanda de tratamientos efectivos para la CoD.

Un enfoque prometedor es el desarrollo de endopeptidasas que escindan los péptidos tóxicos y, por lo tanto, actuarían como glutenasas de buena fe para la terapia enzimática oral10,11,12, similar a las tabletas de lactasa para la intolerancia a la lactosa13. Este enfoque también beneficiaría a los pacientes que padecen sensibilidad al gluten no celíaca, que tiene una prevalencia mundial de hasta el 13 %, y el síndrome del intestino irritable, con una prevalencia de <0,5 %8,14,15. Una glutenasa candidata debe cumplir ciertos criterios para su aplicación clínica. En primer lugar, debe funcionar en el estómago durante la digestión, antes de que el bolo gástrico pase al duodeno e inicie la respuesta autoinmunitaria y, por lo tanto, debe permanecer estable y activo en el entorno gástrico ácido (pH ~2.5), además de resistir la pepsina gástrica. En segundo lugar, una dosis razonable debería digerir eficientemente la gliadina y el 33-mer cuando se combina con pepsina en condiciones gástricas, lo que requiere el procesamiento de grandes cantidades de proteína dietética. En tercer lugar, no debería dañar las estructuras intestinales ni inhibir la absorción de nutrientes y, por lo tanto, idealmente debería estar inactivo en el pH posprandial ligeramente ácido del duodeno16.

Se ha evaluado el potencial terapéutico de varias glutaminil y prolil endopeptidasas (PEP), que representan varias clases catalíticas y diversas fuentes, incluidas bacterias, hongos, insectos y cereales en germinación7,10,11,12. Estos incluyen una PEP de serina de Aspergillus niger10,17; STAN1, una combinación de aspergillopepsina de aspartato de A. niger y serina dipeptidil-peptidasa IV18 de Aspergillus oryzae; latiglutenasa, una combinación de una cisteína peptidasa específica de glutamina de cebada y una oligopeptidasa específica de serina prolil modificada de Sphingomonas capsulata19; serina endopeptidasas de tipo subtilisina de los colonizadores orales naturales Rothia aeria y Rothia mucilaginosa11; y las enzimas sintéticas KumaMax y Kuma062/TAK-062, desarrolladas por el rediseño computacional de la kumamolisina, una serina endopeptidasa de la bacteria Alicyclobacillus sendaiensis20. Sin embargo, ninguno de estos candidatos cumple con todos los requisitos anteriores. Los principales candidatos actuales no muestran una actividad alta en condiciones de pH gástrico y/o requieren dosis muy altas o modificaciones protectoras, como la PEGilación o la microencapsulación. Por lo tanto, los ensayos clínicos aún no han logrado una remisión clínica significativa en celíacos y no han demostrado la capacidad de estas enzimas para reemplazar una dieta sin gluten12. Peor aún, muchas de las denominadas preparaciones enzimáticas que actualmente se venden sin receta como suplementos dietéticos de DQO no inactivan los péptidos tóxicos del gluten y, por lo tanto, representan un peligro para los celíacos21.

La neprosina es una endopeptidasa de 380 residuos de clase y mecanismo desconocidos, actualmente asignada a la familia U74 en la base de datos MEROPS (www.ebi.ac.uk/merops22). Es un PEP que se descubrió en el líquido digestivo de la planta carnívora Nepenthes × ventrata, que atrapa animales de presa en su cántaro23,24,25,26. La enzima podría tener una función en el metabolismo de las proteínas durante la digestión y/o defensa de la presa23. En combinación con otras peptidasas del líquido digestivo, se ha identificado como parte de una posible preparación de glutenasa24. La neprosina purificada también se considera un reactivo útil para la proteómica25,26.

Aquí, establecemos un sistema de producción recombinante humano para producir altos rendimientos de neprosina. Determinamos su mecanismo de activación in vitro así como su estabilidad térmica, perfil de pH, actividades proteolíticas y peptidolíticas generales y susceptibilidad a un panel de inhibidores de peptidasa. También probamos la escisión de la gliadina y el 33-mer in vitro para evaluar la capacidad de la neprosina para actuar como una sola glutenasa. Además, evaluamos el efecto de la neprosina recombinante en el procesamiento de gliadina en ratones. Finalmente, informamos la estructura cristalina del zimógeno de neprosina y su forma madura en complejos que imitan el producto. Estos datos revelan el mecanismo de latencia, las arquitecturas general y del sitio activo, el mecanismo catalítico y la clase de peptidasa, que han sido validados por una cohorte de mutantes.

Estudios previos de neprosina usaron principalmente la enzima purificada del líquido de la planta de jarra porque la expresión heteróloga en Escherichia coli produjo solo una enzima parcialmente impura con un rendimiento modesto24,25. No pudimos reproducir este enfoque, por lo que desarrollamos un sistema basado en células humanas, asumiendo que se requiere un procesamiento postraduccional eucariótico. Esto produjo ~ 10 mg / L de proteína de longitud completa pura bien plegada con una etiqueta de hexahistidina C-terminal (His6) (41 kDa) o ~ 8 mg / L con una etiqueta de estreptavidina gemela (Strep) (43 kDa) ( Figura 1a, b). La proteína se plegó correctamente y se mantuvo estable durante varias semanas a 4 °C en un tampón neutro, pero carecía de actividad proteolítica, lo que atribuimos a que la proteína de longitud completa es el zimógeno pro-neprosina. De hecho, experimentó fácilmente una maduración autolítica en el enlace P128–S129 (numeración de residuos de neprosina en superíndice; UniProt ID C0HLV2) con el tiempo cuando se incubó en un tampón altamente ácido, lo que produjo el dominio catalítico de neprosina (CD) y el prodominio extirpado (PD). ) (Fig. 1e). Este último finalmente se degradó, y tanto la proneprosina como la neprosina migraron como monómeros cuando se verificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño calibrada (SEC) (Fig. 1d).

a Purificación de pro-neprosina de tipo salvaje (WT) por cromatografía de afinidad con His6- o (b) Strep-tag. Las fracciones de flujo continuo (FT), lavado (W) y elución (E1-E3) se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie, junto con marcadores de masa molecular (carril M). Los paneles son representativos de tres experimentos independientes. c Mutantes de proneprosina (K118A, H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188A, E188Q, Y214A, E297Q y E297A) después de la purificación por afinidad con la etiqueta His6 en comparación con las formas WT de (a) y (b). Figura representativa de dos experimentos independientes. d Perfiles de cromatografía de exclusión por tamaño de proneprosina con etiqueta His6 (magenta), neprosina con etiqueta Strep (verde) y neprosina con etiqueta His6 (azul) separadas en una columna Superdex 75 10/300 GL. Cada curva está etiquetada con el volumen de elución en ml, que representa a los monómeros en todos los casos. e Maduración autolítica de la proneprosina a lo largo del tiempo a 37 °C en un tampón ácido. Figura representativa de dos experimentos independientes. f Activación de variantes de pro-neprosina (carriles Z) por autólisis ácida (carriles A) o en trans mediante la adición de neprosina marcada con estreptococo (carriles S). El mutante K118A (tercer panel) se obtuvo como una proteína preactivada después de la purificación por afinidad, revelando bandas separadas de PD y proteína madura (carril Z), que se activaron completamente mediante la incubación en un tampón ácido (carril A). Figura representativa de dos experimentos independientes. Para los distintos paneles de esta figura, los datos de origen relevantes se proporcionan como un archivo de datos de origen si es adecuado.

La fluorimetría de barrido diferencial utilizando el enfoque de termofluor27 reveló una temperatura de transición media (Tm) de 68 °C para la enzima madura (Fig. 2a), que es notable para una peptidasa que funciona en un rango de temperatura ambiente y recuerda más a las enzimas hipertermófilas28 . Además, la Tm del zimógeno fue 9 °C más alta (Fig. 2a), lo que sugiere que la PD promueve la estabilidad y, posiblemente, el plegamiento correcto de la proteína de longitud completa como se informó para otros zimógenos29. Esto fue respaldado por nuestra incapacidad para expresar la neprosina madura (sin la PD) utilizando el mismo sistema de expresión. Finalmente, los estudios de termofluor en presencia de un agente reductor revelaron un proceso de desarrollo con dos transiciones, la primera ocurriendo a 42–44 °C (Fig. 2b). Esto indicó la existencia de enlaces disulfuro que estabilizan la proteína, como se analiza con más detalle a continuación.

a Fluorimetría de barrido diferencial que muestra curvas duplicadas de variación de fluorescencia dependiente de la temperatura durante la desnaturalización térmica de la neprosina (rojo oscuro) y la proneprosina (verde). Las temperaturas intermedias de transición (Tm) son los puntos de inflexión promedio de las dos curvas respectivas. b Igual que (a), que ilustra el efecto de TCEP como agente reductor a 5 mM (rojo) y 10 mM (verde) en comparación con la proneprosina no tratada (azul). c La actividad dependiente del pH de pepsina (rojo), tripsina (verde) y neprosina (azul) en un sustrato BSA fluorescente. Para la neprosina, los datos son medias ± DE (n = 3 experimentos independientes). Los valores de tripsina y pepsina se midieron una vez. d, e Cinética de la escisión mediada por neprosina de los péptidos fluorogénicos (d) FS6 (neprosina 100 nM) y (e) FS6-QPQL (neprosina 25 nM). Los recuadros muestran los valores Vmax, kcat, KM y kcat/KM correspondientes. f Actividad peptidolítica de neprosina de tipo salvaje (WT) y mutantes en el péptido fluorogénico FS6-QPQL. Significación estadística determinada por la prueba t de Student bilateral (*p < 0,1; **p < 0,05; ***p < 0,001). Para las siete barras con ***, los valores de p fueron, de izquierda a derecha, 0,0052, 0,0050, 0,0036, 0,0036, 0,0029, 0,0033 y 0,0034. g Logotipo que representa la preferencia de sustrato de la neprosina según el nuevo análisis de los datos depositados25. h Efecto de las moléculas o mezclas de prueba (1) 1,10-fenatrolina, (2) AEBSF, (3) fosforamidón, (4) marimastat, (5) completo, (6) BGP, (7) captopril, (8) DAN, (9) BEOPC, (10) AMP, (11) pepstatina A y (12) EPNP en comparación con el control WT (C). Solo los dos últimos compuestos logran una inhibición significativa. Significación estadística determinada por la prueba t de Student bilateral (*p < 0,1; **p < 0,05; ***p < 0,001). Para las dos barras con ** y *, los valores de p fueron 0,0215 y 0,0698, respectivamente. i Gráfica de la actividad inhibidora de pepstatina A (izquierda) y EPNP (derecha) que muestra las concentraciones del probador con los valores IC50 derivados. Para los paneles d–f, h e i, los datos son medias ± SD (n = 3 experimentos independientes) y los datos de origen relevantes se proporcionan como un archivo de datos de origen si es adecuado.

Investigamos el efecto del pH en la escisión de la albúmina de suero bovino fluorescente (BSA) por la neprosina, usando pepsina gástrica, una aspartato peptidasa, y tripsina pancreática, una serina peptidasa, para comparar (Fig. 2c). El pH óptimo de la neprosina fue 3, cercano al de la pepsina gástrica (pH < 2). Por el contrario, el pH óptimo de la tripsina era 8, un valor en el que tanto la pepsina como la neprosina eran completamente inactivas. La pepsina se inhibió irreversiblemente a pH neutro, como se informó anteriormente30, mientras que la neprosina se activó e inactivó de manera reversible cambiando entre pH 2,5 y 9,0. Además, la neprosina no se vio afectada por la congelación o la liofilización a pH 7,5 para el almacenamiento, recuperando así su actividad completa después de la descongelación o la resuspensión en un tampón ácido, respectivamente. Finalmente, la neprosina fue insensible a la escisión por pepsina a pH ácido. Este perfil de actividad, eficiencia, estabilidad y robustez era, por lo tanto, consistente con una enzima digestiva que debe trabajar durante escalas de tiempo prolongadas en condiciones variables, precisamente el entorno natural en los cántaros de las plantas carnívoras31.

Para obtener más información sobre la especificidad del sustrato de la neprosina y guiar nuestros ensayos de escisión, volvimos a analizar los datos de proteómica publicados basados ​​principalmente en material purificado, que había identificado la enzima como una PEP25 de buena fe. Encontramos 3001 sitios de escisión únicos que abarcan P6-P6 '(nomenclatura de subsitio de sustrato y sitio activo basada en 32,33), 1863 (62%) de los cuales presentaban un residuo de prolina en P1 (Fig. 2g). La prolina también se enriqueció al doble de su abundancia natural en P2 y P3', pero fue fuertemente desfavorecida en P1' y P2'. El glutamato y la metionina se enriquecieron tres veces en P2 ', la alanina se aceptó fácilmente en P6-P6' y la glicina se desfavoreció significativamente en P1-P3'. Estos datos revelaron una fuerte preferencia por los sustratos con prolina en P1 y que las posiciones específicas dentro de P6-P6 'no eran adecuadas para ciertos aminoácidos (Fig. 2g).

Investigamos la capacidad de la neprosina para digerir la gliadina en presencia y ausencia de pepsina mediante SDS-PAGE y turbidimetría, en comparación con la pepsina sola (Fig. 3a, b). Ambas enzimas degradaron eficientemente la gliadina por separado en concentraciones por debajo de ~5 μM, el umbral fisiológico de la pepsina34, pero se lograron resultados óptimos cuando se combinaron ambas enzimas. Sorprendentemente, la concentración óptima de neprosina fue similar a la de la pepsina gástrica y en órdenes de magnitud más bajos que los requeridos para los candidatos actuales de glutenasa. La zimografía mostró que la neprosina degradó la gliadina y la gelatina, también una proteína dietética, con una eficiencia similar (Fig. 3d, e).

un análisis SDS-PAGE de gliadina expuesta a concentraciones crecientes de pepsina (izquierda), neprosina (centro) o neprosina más pepsina (derecha). Figura representativa de dos experimentos independientes. b Curvas que representan la escisión de gliadina como en (a) a lo largo del tiempo medida por turbidimetría. c Espectros de masas, de arriba a abajo, del péptido de 33 unidades (3912 Da); el péptido 33-mer después de la incubación con neprosina 0,5 µM durante 0 min, 20 min y durante la noche; neprosina sola; y el péptido 33-mer después de la incubación durante la noche con pepsina 10 μM, que deja el péptido intacto. d Zimograma de gliadina que representa la actividad de la neprosina (carril izquierdo) y la enzima madura resultante de la autoactivación de la proneprosina (carril derecho). e Igual que (d) pero mostrando zimografía de gelatina. f Secuencia del 33-mer y extensión de los seis epítopos de unión a HLA-DQ2.5 superpuestos, como se destaca mediante flechas dobles rojas7. Las glutaminas susceptibles de desamidación por transglutaminasa se muestran en círculos morados11. El péptido corresponde al segmento L76–F108 de α-gliadina (UniProt ID P18573). g La escisión del péptido 33-mer por la neprosina a lo largo del tiempo procede según dos vías (superior e inferior). Para los distintos paneles de esta figura, los datos de origen relevantes se proporcionan como un archivo de datos de origen si es adecuado.

A continuación, investigamos la escisión del 33-mer, que incluye tres residuos de glutamina que son desamidados por transglutaminasa y seis epítopos de células T HLA-DQ2.5 inmunogénicos superpuestos6,11,35, por espectrometría de masas (Fig. 3f). Descubrimos que el péptido a 250 μM se degradó de manera eficiente con neprosina 0, 5 μM, una proporción de 500: 1, después de 20 minutos a pH 3 (Fig. 3c). No se detectaron productos de escisión autolítica incluso después de la incubación durante la noche, lo que confirmó la estabilidad de la enzima madura en condiciones ácidas. Por el contrario, la pepsina no logró escindir el péptido incluso después de una noche de incubación a una concentración 20 veces superior a la de la neprosina, lo que confirmó la resistencia del 33-mero frente a las peptidasas digestivas. El análisis de los fragmentos de escisión peptídica generados por la neprosina reveló dos productos finales: Q–L–P–Y–P–Q–P (843 Da) y L–Q–L–Q–P–F–P–Q–P ( 1068 Da). Al monitorear la reacción a lo largo del tiempo (Fig. 3g), encontramos que la escisión solo ocurrió inmediatamente aguas abajo de cinco residuos de prolina específicos entre los 13 presentes en el 33-mer, preferiblemente en P-Q-P*Q-L-P y siempre con P–Q–P en los subsitios P1–P3, lo que califica la especificidad simple para la prolina en P1 deducida de la proteómica indiscriminada y está en línea con los residuos hidrofóbicos grandes desfavorables (leucina, fenilalanina y tirosina) en P2 como se discutió anteriormente25. En general, nuestros resultados demuestran que el 33-mer se degrada en múltiples sitios que presentan el motivo Q–P*Q–L. Sorprendentemente, también se encuentran dos dipéptidos P-Q en BSA, junto con cinco sitios P-E igualmente favorecidos (ver arriba), lo que explica por qué la albúmina es un sustrato adecuado para la neprosina a pH bajo.

Finalmente, probamos la escisión de una cohorte de péptidos fluorogénicos. Encontramos que el péptido FS6 que contiene un enlace P-L (Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2), que es un sustrato de metaloproteinasas de matriz y adamalysins36, se escindió con modesta eficiencia de acuerdo con análisis cinético (kcat/KM = 765 M−1s−1; Fig. 2d). Por el contrario, la variante peptídica FS6-QPQL, rediseñada para incluir el sitio de escisión de neprosina del 33-mer (Mca–Q–P–Q–L–Dpa–A–R–NH2), se escindió 30 veces más eficientemente, principalmente debido al aumento de kcat (kcat/KM = 23,880 M−1s−1; Fig. 2e). En consecuencia, la neprosina se puede definir como una PEP con una especificidad más restringida que la P-X que degrada eficientemente el 33-mer en condiciones similares a las gástricas.

Dada la clase catalítica desconocida de la enzima, a continuación probamos un panel de inhibidores de peptidasa por su capacidad para bloquear la escisión de FS6-QPQL por la neprosina (Fig. 2h). También seguimos un enfoque aplicado recientemente para encontrar inhibidores de la pirrolina-5-carboxilato reductasa37, cuyo producto es la prolina, y probamos una serie de compuestos que imitan o contienen prolina. Encontramos que solo la pepstatina A y el 2-[(4-nitrofenoxi)metil]oxirano (EPNP) inhibieron débil pero significativamente la neprosina (Fig. 2h), con valores de concentración inhibitoria media máxima (IC50) de 140 y 480 μM, respectivamente ( Figura 2i). Dado que la pepstatina y los epóxidos similares a EPNP son inhibidores de las endopeptidasas de aspartato de tipo pepsina38,39, que no comparten similitud de secuencia con la neprosina, esto apuntó a un tipo de peptidasa inesperado y un mecanismo de catálisis para la neprosina.

Para investigar la actividad de la neprosina in vivo, se alimentó a los ratones con un bolo de gliadina 5 min después de recibir el zimógeno en una relación de masa muy baja (1:500 p/p) o vehículo. Después de 2,5 h, recolectamos el contenido de tres segmentos del tracto gastrointestinal superior y medimos la concentración de 33-mer mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (Fig. 4). El péptido fue sustancialmente menos abundante en todos los segmentos de los animales tratados (61-91%) y en un 71% en general. Por lo tanto, el zimógeno inactivo se activa al llegar al estómago y ayuda de manera eficiente a descomponer la gliadina (y particularmente el 33-mer) in vivo mientras permanece resistente a las enzimas digestivas fisiológicas. Esto ocurre en concentraciones mucho más bajas que las de las candidatas a glutenasas y sin estrategias protectoras como la PEGilación o la microencapsulación. Estos resultados son consistentes con un estudio anterior que informó que los ratones NOD/DQ8 sensibilizados mostraron una disminución significativa en los marcadores inflamatorios cuando se alimentaron con gliadina predigerida con pepsina y líquido de jarra de Nepenthes, que incluía, entre otros componentes, neprosina y nepentesina24.

Cantidad de 33-mer (μg) en el contenido total del estómago (S), intestino delgado proximal (pSI) e intestino delgado distal (dSI) de ratones que recibieron zimógeno de neprosina (N) o vehículo (V) antes de un bolo de gliadina. Los resultados son medias ± SEM (n = 8 animales por grupo). La significación estadística se determinó mediante una prueba F unilateral (*p < 0,05, N frente a B). Los valores de p fueron 0,048 (S), 0,049 (pSI), 0,026 (dSI) y 0,021 (Total). Los datos de origen relevantes se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Cristalizamos pro-neprosina en un grupo espacial ortorrómbico (Fig. 5a y Tabla complementaria 1) y descubrimos que el polipéptido se escindió en el sitio de maduración fisiológica (P128–S129). Por lo tanto, los cristales contenían el complejo zimogénico de la PD escindida y la CD (Fig. 5a). Resolvimos la estructura mediante difracción anómala de longitud de onda única, recopilando datos en la longitud de onda del borde de absorción de lutecio LIII de un cristal empapado en Lu-Xo440 (Fig. 5b). Este remojo condujo a una variación significativa en uno de los ejes de las celdas de cristal en comparación con los cristales nativos, manteniendo una buena difracción de rayos X (Tabla complementaria 1). El modelo refinado final del complejo derivado se utilizó para resolver la estructura de proneprosina nativa mediante reemplazo molecular. Además, la neprosina madura produjo dos formas cristalinas monoclínicas diferentes, I y II (Fig. 5a y Tabla complementaria 1), cuyas estructuras también se resolvieron mediante reemplazo molecular.

a Los cristales ortorrómbicos de proneprosina (panel izquierdo) contenían un complejo de PD (p) escindido y CD (e) (panel central izquierdo). Los cristales de enzima maduros eran monoclínicos (panel central derecho, forma de cristal I; panel derecho, forma de cristal II). El experimento del panel centro-izquierdo se realizó una vez. b La estructura de la proneprosina se resolvió usando un derivado de lutecio. En un sitio (panel izquierdo), el catión Lu3+ (esfera verde) no estaba coordinado por dos oxígenos de carboxilato más cinco átomos de nitrógeno del andamio orgánico y los oxígenos de carboxilato del residuo de proteína E89 a distancias que abarcan 2,40–2,65 Å. Mapa de Fourier de tipo final (2mFobs-DFcalc) de la derivada contorneada en 1,3 σ (panel derecho). c Gráfica tipo cinta de proneprosina en perspectivas frontal (panel izquierdo) y lateral (panel derecho). El PD es dorado con hélices magenta. La enzima madura se muestra en el salmón. Los segmentos desordenados/cortados se indican mediante líneas discontinuas grises. Los dos sitios de glicosilación en N145 y N152, las siete cisteínas, A60 y los dos glutamatos catalíticos (E188 y E297) se muestran para sus cadenas laterales y están etiquetados. El mapa de Fourier final alrededor de las dos cadenas de glucano se representa en 0,6 σ. d Topología de la proneprosina con hebras como flechas (etiquetadas como β1–β22) y las dos hélices cortas (α1 y α2) como bastones magenta. Se indican los residuos terminales de cada elemento de estructura secundaria. El PD tiene hebras amarillas y hélices magenta, la hoja frontal del resto de la enzima madura es de color naranja y la hoja posterior es de color marrón. Las siete cisteínas se indican además en verde, los glicanos se muestran como rombos verdes. Los glutamatos catalíticos están marcados como referencia. e La fila superior muestra la vista frontal de la proneprosina como en (c) (izquierda) y la vista posterior (derecha), ambas muestran el PD como una cinta amarilla y la superficie coulómbica del CD (rojo, –10 kcal/mol ·e; azul, +10 kcal/mol·e) calculado con Chimera85. El pI calculado del componente enzimático maduro es 4,3. La fila inferior muestra lo mismo excepto que aquí se muestra el PD para su superficie de Coulombic (pI = 9.5) y el CD como cinta de salmón.

La proneprosina es una molécula oblonga compacta de ~ 55 × ~ 45 × ~ 40 Å (Fig. 5c). El PD N-terminal (R25–P128) se define en el mapa de Fourier final desde A29 en adelante y presenta una parte globular (A29–G112) seguida de un enlazador (L113–P128) al CD aguas abajo (S129–Q380). El segmento (N122–N131), que incluye el sitio de maduración escindido, es flexible. El PD presenta una hoja β antiparalela de tres cadenas en la que la cadena central se divide en dos por la inserción de la cadena más a la izquierda (Fig. 5c, d). Las dos hebras derechas están conectadas por un segmento largo en la parte superior, que incluye dos hélices α cortas, un enlace disulfuro (C52–C98) y un segmento desordenado de 10 residuos (Y77–N86) en la parte posterior de la molécula. Este último probablemente se deba a la cadena de glicano que sobresale unida a N152 dentro de una hebra posterior del CD (Fig. 5c). Un segundo glucano se une a N145 desde un bucle cruzado en la parte superior del CD. Más allá de la última hebra del PD, la cadena experimenta un giro de 90° y entra en el enlazador PD/CD, que corre en conformación extendida a lo largo de la superficie frontal del CD.

De manera atípica para las peptidasas, que generalmente son proteínas α/β41, la CD es un sándwich β antiparalelo, con una lámina frontal fuertemente rizada de siete hebras y una lámina posterior de ocho hebras, que proporciona un andamiaje para la primera (Fig. 5c, d). Ambas hojas están interconectadas por nueve bucles cruzados, que incluyen una horquilla larga β12β13 y dos enlaces disulfuro adicionales (C219–C224 y C358–C379) a cada lado del sándwich (Fig. 5d). Todos estos elementos contribuyen a una estructura compacta y resistente, lo que explica la notable estabilidad del pH de la neprosina y su capacidad para resistir la digestión con pepsina. Por el contrario, los enlaces disulfuro no están profundamente enterrados en la estructura, lo que explica su sensibilidad a los agentes reductores. La estructura de la forma cristalina de neprosina madura I (Tabla complementaria 1) resultó ser prácticamente idéntica a la parte equivalente del zimógeno, con una desviación cuadrática media de la raíz central (RMSD) de 0,62 Å. La única diferencia significativa se encontró en N232–Y233, que se pliega hacia afuera en el zimógeno para acomodar I103 al comienzo de la hebra más a la derecha de la PD. La forma de cristal II, a su vez, era prácticamente indistinguible de la forma de cristal I (RMSD central = 0,66 Å), excepto por la punta del bucle Lβ21β22, que estaba separada por 3,8 Å, y la etiqueta C-terminal, que se reorientó debido al cristal. embalaje. Por lo tanto, el componente enzimático maduro se preforma esencialmente en el zimógeno como se observa en la mayoría de las peptidasas, con la notable excepción de las serina peptidasas de tipo quimotripsina42,43,44.

Presumimos que la hendidura del sitio activo estaría delineada por el conector PD (Fig. 6a) como se encuentra en otros zimógenos42,44. Además, en las estructuras de los cristales maduros de neprosina I y II, el segmento C-terminal, que abarcaba un tripéptido de alanina-isoleucina-alanina seguido de la etiqueta His6, corría a lo largo de la superficie de una pareja de simetría, imitando así un complejo de productos. . Ambas formas de cristal eran monoclínicas pero con diferentes constantes de celda (Tabla complementaria 1), lo que resultó en un empaque de cristal variable. Aun así, la etiqueta C-terminal penetra en la hendidura de manera similar en ambos arreglos cristalográficos, pero se desplaza tres posiciones, de modo que H404–H409 de la forma cristalina I se superpone a A401–H406 de la forma cristalina II (Fig. 6b, c) . En consecuencia, la neprosina poseería una hendidura extendida en el sitio activo que atraviesa la cara cóncava de la lámina, que es oblicua a la dirección de las hebras β de la lámina frontal en ~55° (Fig. 6a-c).

un primer plano de la Fig. 5c que representa el segmento final (L113–P121) de la PD definida en el mapa de Fourier final como un modelo de barras con carbonos amarillos y números de residuos negros que atraviesan la hendidura del sitio activo. Los posibles residuos P1 y P1′–P3′ están marcados. Además, los residuos seleccionados del sitio activo se representan por sus cadenas laterales con carbonos en canela y numerados en azul claro. Dos residuos de solventes potencialmente relevantes para la catálisis se muestran como esferas verdes. El recuadro proporciona una vista de primer plano ligeramente rotada para resaltar la interacción (líneas magenta) de K118 con E188, Q173 y una molécula de solvente. b Igual que (a) que representa el complejo producto de la neprosina madura (forma cristalina I), con la cola C-terminal de un compañero de simetría que abarca A403 y los residuos de la etiqueta His6 (H404–H409) como un modelo de barra con carbonos en cian con subsitios de sustrato P6-P1. Una molécula de solvente potencialmente relevante para la catálisis (esfera verde) une E297 y E188 (barras magenta). c Igual que (b) para la forma cristalina II. La cola C-terminal de una pareja de simetría que abarca A401 y parte de la etiqueta His6 (H404–H408) se muestra como un modelo de barra con carbonos en ciruela, que probablemente cubre los subsitios P6–P1′. Una molécula de solvente potencialmente relevante para la catálisis (esfera verde) une E297 y E188 (barras magenta). Una segunda molécula de solvente (flecha amarilla) probablemente ocupa la posición del oxígeno del carbonilo escindible en el complejo de Michaelis. Las cadenas polipeptídicas de ambas formas cristalinas se superponen para los residuos de etiquetas H404–H409 (forma cristalina I) y A401–H406 (forma cristalina II) tras la superposición de los respectivos CD. d Modelo del probable complejo de Michaelis entre un sustrato que abarca los residuos P–Q–P*Q–L–P (carbonos verdes) en las posiciones P3–P3′ y el sitio activo de la neprosina. Los residuos seleccionados se muestran por su cadena lateral (carbonos de ciruela) y se etiquetan. El solvente catalítico se representa como una esfera cian. e Mecanismo químico propuesto de escisión del sustrato por la neprosina.

En la búsqueda de posibles residuos catalíticos, nos inspiramos en las peptidasas aspárticas de tipo pepsina funcionalmente análogas, que a pesar de su arquitectura dispar son también principalmente proteínas β y operan a pH altamente ácido45. Además, también se sabe que los únicos inhibidores de neprosina (débiles) que pudimos encontrar inhiben las aspartato peptidasas (ver arriba). Estas enzimas utilizan un par de residuos aspárticos unidos por una molécula de disolvente para la catálisis46. De hecho, encontramos un par sorprendente de residuos de glutamato (E188 y E297) unidos por una molécula de solvente que pellizca los péptidos unidos en los complejos de productos (Fig. 6b, c). En la forma cristalina II, una segunda molécula de solvente claramente resuelta reemplazaría el oxígeno del carbonilo escindible de un sustrato (Fig. 6c). El par de glutamato estaba dispuesto de manera similar en la estructura del zimógeno, aunque un poco más separados (Fig. 6a). Por lo tanto, producimos mutantes puntuales E188Q, E188A, E297Q y E297A de proneprosina marcada con His6 para la prueba (Fig. 1c). Estas variantes no se autoactivaron cuando se incubaron a pH ácido (Fig. 1f), por lo que la activación se desencadenó en trans usando cantidades catalíticas de neprosina de tipo salvaje marcada con estreptococo madura. Finalmente, obtuvimos variantes maduras bien plegadas e intactas de los mutantes E188Q y E297Q, pero no E297A o E188A (Fig. 1f), y estos de hecho eran catalíticamente inactivos (Fig. 2f). Por lo tanto, E188 y E297 pueden actuar como una díada catalítica, revelando que la neprosina es una glutamato peptidasa, una clase catalítica que (en contraste con las aspartato peptidasas) se ha estudiado muy poco47. Esto está de acuerdo con predicciones muy recientes basadas en estudios de bioinformática pero no validadas experimentalmente48. Nuestros resultados sugieren que las estructuras de neprosina maduras imitan los complejos de productos aguas arriba que ocupan colectivamente los subsitios S6 a S1 '(Fig. 6b, c), con los dos glutamatos catalíticos más la molécula de solvente puente preparada para la reacción. A medida que el conector PD se extiende por más residuos en el lado derecho de la hendidura en el zimógeno (Fig. 6a), estos corresponderían a posiciones hasta P3 '. Por lo tanto, junto con el espacio adicional en la hendidura más allá de S3', la neprosina presentaría una hendidura extendida, que probablemente abarcaría hasta 11 subsitios (S6-S5'), lo que explica la necesidad de péptidos extendidos más allá del enlace escindible (ver arriba).

En ausencia de un complejo de sustrato, construimos un modelo para el complejo de Michaelis de neprosina con el péptido P–Q–P*Q–L–P basado en las estructuras que imitan el zimógeno y el complejo del producto (Fig. 6d). Este modelo reveló más residuos en la proximidad de los glutamatos catalíticos con funciones catalíticas o de unión potenciales. Por lo tanto, mutamos los residuos H134, Y136, Q173, W175 e Y214 (Fig. 6a-d) reemplazándolos con alanina y purificamos las proteínas correspondientes (Fig. 1c). Todos los mutantes requerían activación en trans como se discutió anteriormente (Fig. 1f). La actividad de H134A, Y136A e Y214A fue aproximadamente un 80 % más baja que la enzima de tipo salvaje, mientras que los mutantes Q173A y W175A estaban totalmente inactivos (Fig. 2f). Concluimos que H134, Y136 e Y214 son relevantes pero no críticos para la catálisis, posiblemente desempeñando un papel auxiliar en el mecanismo catalítico, mientras que Q173 y W175 son esenciales (ver más abajo).

El PD se une lateralmente al lado izquierdo de la enzima madura, de modo que su lámina β central gira ~90° alejándose del plano de la lámina frontal. La superficie entre dominios tiene una ganancia de energía libre de solvatación tras la formación de la interfaz (ΔiG) de –25,8 kcal/mol49, lo que indica una interacción muy fuerte. Además, el complejo entierra 2176 Å2, lo que supera el valor promedio informado de 1910 Å2 para los complejos proteína-proteína50. El PD (pI teórico = 9,5; Fig. 5e, abajo) tiene forma de media luna y abraza cómodamente el CD (pI = 4,3; Fig. 5e, arriba) bajo complementación electrostática, lo que contribuye a la represión de la actividad y la estabilidad del zimógeno (pI = 5,9 ) a valores de pH neutros o ligeramente ácidos. Además, la íntima interacción zimógena explica aún más la notable estabilidad de la proneprosina en los ensayos de cambio térmico (ver arriba). Finalmente, la importancia del PD se evaluó aún más mediante la prueba del mutante puntual A60R, diseñado para desestabilizar la interfaz (Fig. 5c, panel izquierdo). Esta mutación impidió el aislamiento de una proteína plegada.

Una vez secretada al fluido digestivo ácido, la protonación de residuos cargados negativamente conduce a la repulsión de las cargas positivas netas, de modo que el zimógeno se deshace con la liberación del resto maduro preformado y la hendidura del sitio activo. La posición S1 de la hendidura está ocupada por K118 del conector PD en la estructura de zimógeno, que se obtuvo a pH 7,5. Este residuo forma un fuerte puente salino con E188 catalítico y un enlace de hidrógeno con Q173Nε2, que es esencial (ver arriba y la Fig. 6a, recuadro). Por lo tanto, producimos y probamos el mutante K118A, que se sobreexpresó de manera eficiente pero experimentó una maduración autolítica parcial en un tampón neutral, condiciones en las que la enzima de tipo salvaje y otros mutantes permanecieron intactos (Fig. 1c). La incubación posterior a pH 2,5 completó el proceso de activación (Fig. 1f). Como se esperaba, la actividad del mutante maduro fue similar a la de la enzima de tipo salvaje (Fig. 2f).

Con base en lo anterior, proponemos que el par K118-E188 presenta un tapón de latencia que puede debilitarse una vez que el zimógeno alcanza un ambiente ácido siguiendo un mecanismo de cambio de pH, por lo que el enlazador PD se extrae para la escisión de maduración. Esto recuerda a las aspartato peptidasas digestivas, pepsina y gastricina, que presentan un residuo de lisina funcionalmente equivalente a K11843,51, y a la peptidasa lisosomal legumain52. El mecanismo de cambio de pH y el hecho de que el enlace peptídico escindible P1′-P1 está intercalado por la cadena lateral Y214 para que no sea accesible para la escisión (Fig. 6a), explica por qué el enlazador de zimógeno puede unirse en la dirección de un sustrato a la hendidura a pH neutro sin ser escindido. Esto contrasta con la mayoría de los zimógenos, incluidas las aspartato peptidasas digestivas, en las que los prosegmentos interactúan de una manera que no es un sustrato con los residuos maduros de la enzima como mecanismo para evitar la activación prematura42,43,44. Finalmente, dado que la posición del enlace escindible en la hendidura está ocupada por K118-Q119 pero la maduración ocurre en P128-S129, la activación probablemente ocurre en trans por una segunda molécula enzimática una vez que el conector PD se libera de la hendidura.

En base a los resultados anteriores, el mecanismo de escisión catalítica de la neprosina procedería de la siguiente manera. El solvente que une los carboxilatos E188 y E297 en los complejos de productos representaría el agua catalítica en estado fundamental (Fig. 6e, paso I). El agua está más cerca de E297, lo que sugiere que E188 puede estar protonado, como se informó para uno de los dos aspartatos catalíticos en las peptidasas ácidas de tipo pepsina46. E297 se mantiene mediante enlaces de hidrógeno con H134Nε2 e Y136Oη, mientras que E188 se mantiene mediante enlaces de hidrógeno con Y214Oη, T186Oγ y Q173Nε1. Durante la reacción, el sustrato se uniría a la hendidura del sitio activo en conformación extendida (Fig. 6e, paso II), con los subsitios S3, S1 y S3 'de la hendidura formados por Y194, Q192 y F169; Y208, Y206, L171, E188 y Q173; y Y136, W175 y E293, respectivamente, que son ideales para el alojamiento de prolinas (Fig. 6d). La cadena principal del sustrato estaría fijada por enlaces de hidrógeno entre sus carbonilos e Y220Oη en P3, H134Nε2 en P2 (habilitado por una rotación de 180º alrededor de χ2 por la unión del sustrato) y Y136Oη en P1′ (Fig. 6d). La inserción del sustrato cambiaría el solvente catalítico más hacia E297, que actuaría como una base general y extraería un protón de él para mejorar su nucleofilia. El carboxilato E188 protonado, a su vez, se uniría al oxígeno del carbonilo escindible (Fig. 6d, e). A partir de entonces, el disolvente polarizado realizaría un ataque nucleofílico en la cara si del carbono del carbonilo escindible, lo que daría como resultado un intermedio de reacción de gem-diolato tetraédrico (Fig. 6e, paso III). Este último estaría estabilizado por los indispensables W175Nε1 y Q173Nε1, en el papel crítico de un agujero de oxianión53. El intermedio luego se resolvería rompiendo el enlace C-N escindible. En esta etapa, E297 actuaría como un ácido general y protonaría el nuevo nitrógeno α-amino (Fig. 6e, paso IV). Finalmente, los dos productos de escisión dejarían la hendidura y la enzima estaría preparada para una nueva ronda de catálisis.

Las peptidasas se asignaron originalmente a cinco clases mecánicas: serina, cisteína, treonina, aspartato y peptidasas dependientes de metales54. En 2004, se caracterizó estructuralmente la glutamato peptidasa fundadora, a saber, la escitalidocarboxil peptidasa B (SCP-B) del hongo dematiáceo Scytalidium lignicolum55,56,57. Desde entonces, solo se ha analizado estructuralmente la peptidasa aspergilloglutámica estrechamente relacionada (~50 % idéntica a SCP-B)58,59, y se han evaluado funcionalmente otras siete, en su mayoría de hongos60,61,62,63,64, pero una de una bacteria65 . Se asignan a la familia G1 en la base de datos MEROPS y se conocen informalmente como el grupo carboxilpeptidasa fúngica insensible a la pepstatina66 o eqolysins55. Son enzimas termófilas e insensibles a la pepstatina que funcionan en condiciones ácidas65 y cuentan con un glutamato catalítico que actúa como una base general polarizadora de solventes, que es E190 en SCP-B (ver UniProt ID P15369 para la numeración de residuos en subíndice de acuerdo con la longitud completa). proteína, y reste 54 para la numeración de enzimas maduras de uso común55,56). El glutamato es asistido por una glutamina (Q107 en SCP-B), de ahí el nombre de familia eqolysins55. Estos residuos son invariantes dentro de la familia y están flanqueados por residuos muy similares66,67.

El SCP-B arquetípico es un sándwich β antiparalelo 7+7 que muestra una similitud general con el CD de neprosina (Fig. 7a). La superposición de neprosina y la forma madura unida de SCP-B (Banco de datos de proteínas [PDB] ID 2IFR56), cuya estructura zimógena se desconoce, reveló 140 residuos alineados con un RMSD central bastante grande de 3,0 Å y una identidad de secuencia de solo el 11 %. . Hay diferencias notables en los bucles de conexión y el sitio activo, por ejemplo, una gran horquilla β que sobresale unida por disulfuro insertada en la enzima fúngica siguiendo la cadena β equivalente a β16 en la neprosina (Fig. 7a). Dentro del sitio activo, el único residuo conservado es el glutamato catalítico (E297 en neprosina y E190 en SCP-B), así como la posición del asistente catalítico (E188 en neprosina y Q107 en SCP-B), que conducen a variables hendiduras del sitio activo con trayectorias de sustrato y perfiles de superficie dispares (Fig. 7b, c). Además, los mutantes cruzados Q107E de SCP-B y E188Q de neprosina, que imitan la díada catalítica de cada uno, están completamente inactivos, como se discutió anteriormente y se informó en68. Esto explica las diferentes especificidades de sustrato, que en SCP-B conducen a la escisión de los enlaces F-F, L-Y y F-Y en la insulina pero no en los enlaces flanqueantes de prolina68.

a Superposición de las trazas de Cα de neprosina (salmón) y SCP-B (azul pálido) en estéreo, con los respectivos residuos catalíticos mostrados como barras y etiquetados (➀, E297/E190 de neprosina/SCP-B; ➁, E188/ Q107 de neprosina/SCP-B). Tenga en cuenta la solapa única de SCP-B que cubre la hendidura del sitio activo (flecha roja). Se indican el extremo N y el extremo C. b Primer plano de la hendidura del sitio activo de la neprosina que se muestra para su superficie de Connolly en la orientación de (a). Se muestran los dos residuos catalíticos (manchas verdes). c Igual que (b) para SCP-B.

Las glutenasas actuales tienen limitaciones para cumplir con los criterios estrictos para una terapia enzimática oral eficaz contra la CoD. Aquí, nuestros estudios in vitro e in vivo demostraron que la neprosina recombinante es una enzima robusta resistente a la pepsina que degrada muy eficientemente la gliadina y su 33-mer en condiciones gástricas simuladas en laboratorio y en el estómago del ratón. Por lo tanto, dosis bajas de la enzima complementan la pepsina gástrica durante la digestión. Nuestros resultados demuestran que el motivo Q–P*Q–L del 33-mer se escinde fácilmente, lo que elimina los seis epítopos inmunogénicos superpuestos al generar péptidos demasiado pequeños para estimular la división de las células T específicas de gliadina69. La eficiencia de escisión de la neprosina in vitro en condiciones gástricas simuladas es mucho mayor que la de otras glutenasas18,20,24,70,71,72. El zimógeno se produce a pH neutro, en el que permanece estable y es liofilizable para su transporte y almacenamiento. Solo se activa después de la ingestión en el estómago y escinde los componentes tóxicos del gluten. Una vez que el bolo gástrico sale al duodeno con pH posprandial ligeramente ácido, vuelve a estar inactivo. Por lo tanto, la neprosina es un candidato muy prometedor para un mayor desarrollo terapéutico contra las afecciones sensibles al gluten.

Los estudios estructurales y funcionales respaldados por mutantes y ensayos de actividad identificaron a la neprosina como una PEP sensible a la pepstatina y como la única glutamato endopeptidasa que se encuentra en los eucariotas superiores. Presenta un par de glutamatos catalíticos no descritos hasta ahora que son análogos a los aspartatos de las endopeptidasas ácidas de tipo pepsina que de otro modo no estarían relacionadas. La neprosina se produce y secreta como un zimógeno, que se activa solo en su entorno natural fuertemente ácido, el líquido digestivo de la planta de jarra. La maduración sigue un mecanismo de cambio de pH que libera un tapón de latencia mediado por lisina.

Finalmente, la neprosina es sensible a la pepstatina, pero comparte su pliegue general con las glutamato peptidasas resistentes a la pepstatina de la familia eqolysin, que poseen una díada glutamato-glutamina y están representadas por el arquetipo SCP-B. Sin embargo, existen diferencias en el tamaño de la PD y la CD, el entorno del sitio activo, el modo de unión al sustrato y la especificidad, así como el mecanismo químico de la catálisis. Además, mientras que las eqolisinas están restringidas a hongos y bacterias67,73, los posibles ortólogos de neprosina con ~35–40% de identidad de secuencia se encuentran ampliamente en (y restringidas a) plantas, incluidos los cultivos que contienen gluten. Esto sugiere que la familia de las neprosinas puede haberse originado a partir de un ancestro de SCP-B mediante la transferencia horizontal de genes de una bacteria o un hongo a una planta, como se describió anteriormente para otras proteínas74. La transferencia habría sido seguida por una evolución divergente dentro del reino vegetal para modificar uno de los residuos catalíticos y los bucles que decoran el sándwich β central para adaptarse a nuevos sustratos. Por analogía con las eqolysins, los miembros de la familia de las neprosinas podrían denominarse eelysins.

GenScript insertó un gen sintético que codifica la neprosina de tipo salvaje de Nepenthes × ventrata, que es 91 % idéntico al ortólogo de Nepenthes alata (UniProt ID A0A1L7NZU4), en el vector pET-28a(+) para producir el vector pET-28a(+ )-proNEP (para plásmidos y cebadores, consulte la Tabla complementaria 2). La secuencia codificante se transfirió al vector pCMV para producir el vector pS6-proNEP. Esto confirió resistencia a la ampicilina y añadió una etiqueta de hexahistidina C-terminal (His6). La proteína codificada se describe aquí como proneprosina. El mismo plásmido se modificó mediante la clonación de oligonucleótidos hibridados para (a) reemplazar la etiqueta His6 con una etiqueta gemela Strep (pS6-proNEP-Strep) para la expresión de pro-neprosin-strep, y (b) para eliminar la PD (pS6 -NEP) para la expresión de la CD de neprosina (S129–Q380) más la etiqueta His6 C-terminal. Se utilizó el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene) o la mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR inversa para generar variantes de pS6-proNEP con mutaciones puntuales A60R, K118A, H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188A, E188Q, Y214A, E297Q y E297A. Los plásmidos se purificaron con el kit GeneJET Plasmid MaxiPrep (Thermo Fisher Scientific) y las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN.

Se evaluó la sobreexpresión de las proteínas codificadas por los plásmidos pS6-proNEP, pS6-proNEP-Strep y pS6-NEP, así como los mutantes de 11 puntos, en células humanas Expi293F (ThermoFisher Scientific) cultivadas en una incubadora con agitador de células Multitron (Infors HT) a 37 °C. Las células se transfectaron con ADN de plásmido y se recolectaron después de varios días para la purificación de proteínas. El medio acondicionado con células se aclaró mediante centrifugación y se complementó con imidazol, se incubó con resina de ácido nitrilotriacético de níquel (Ni-NTA) (Invitrogen), se sometió a purificación por cromatografía de afinidad por lotes (AC) y se lavó extensamente con tampón que contenía imidazol 20 mM. Las proteínas se eluyeron con el mismo tampón que contenía imidazol 300 mM. Para pro-neprosin-strep, la resina Ni-NTA se reemplazó con resina de suspensión Strep-Tactin XT Superflow (IBA Life Sciences) y las proteínas se eluyeron en un tampón que contenía d-biotina 50 mM (VWR Life Science). Las fracciones que contenían la proteína se combinaron y concentraron antes de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en una columna Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare), que se conectó a un sistema de cromatografía líquida ÄKTA Purifier (GE Healthcare).

Las proteínas se concentraron por ultracentrifugación en dispositivos de filtro Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech). Las concentraciones de proteína aproximadas se determinaron midiendo la absorbancia a 280 nm (A280) usando un BioDrop-DUO Micro Volume (Biochrom) y aplicando los coeficientes de extinción teóricos apropiados. Además, la pureza de la proteína se evaluó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) seguida de tinción con Coomassie (Thermo Fisher Scientific). La identidad de la proteína se determinó mediante huellas dactilares de masa peptídica y secuenciación de Edman N-terminal en el Servicio de Química de Proteínas y la Instalación de Proteómica del Centro de Investigaciones Biológicas (Madrid, España), respectivamente. Finalmente, la neprosina de tipo salvaje madura se liofilizó, se almacenó a –20 °C y se reconstituyó disolviéndola en agua Milli-Q.

Para los ensayos de actividad, el medio acondicionado filtrado de neprosina de tipo salvaje y los mutantes puntuales se complementó con glutatión reducido 3 mM y glutatión oxidado 0,3 mM, el pH se ajustó con Tris·HCl 20 mM pH 8,0 y la mezcla se incubó con cOmplete Resina de purificación His-Tag (Roche). La resina se recogió en una columna abierta y la proteína unida se lavó con Tris·HCl 10 mM pH 7,0, cloruro sódico 300 mM y luego se eluyó con glicina 100 mM pH 2,5, cloruro sódico 300 mM.

Las formas maduras mutantes y de tipo salvaje de neprosina o neprosin-strep se obtuvieron mediante autólisis. Las muestras de proteína eluidas de las columnas Ni-NTA o Strep-Tactin se dializaron contra el tampón, se diluyeron dos veces con glicina 100 mM, pH 2,5, y se incubaron a 37 °C durante un máximo de 16 h. Las reacciones se detuvieron en puntos de tiempo específicos (0 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h, 2 h y toda la noche) hirviendo alícuotas en tampón de muestra SDS reductor/desnaturalizante, seguido de SDS-PAGE. Se cambió el tampón de neprosina madura a Tris·HCl 20 mM pH 7,5, cloruro de sodio 250 mM en una columna PD10 seguido de SEC en una columna Superdex 75 10/300 GL con el mismo tampón. La pureza y la identidad de la proteína se evaluaron como se indicó anteriormente.

Para obtener mutantes puntuales de neprosina madura a partir de zimógenos que no se autoactivan, las proproteínas purificadas (H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188A, E188Q, Y214A, E297Q y E297A) se incubaron con neprosina-estrep activada a un peso de 20:1. relación durante la noche a 37 ° C. La pro-neprosina-estreptococo se intercambió previamente con tampón a glicina 100 mM, pH 3,0, cloruro de sodio 150 mM para la activación. Las muestras escindidas se intercambiaron con tampón y se purificaron mediante cromatografía de afinidad inversa, se concentraron y purificaron mediante SEC.

La proneprosina y la neprosina madura se analizaron mediante fluorimetría diferencial de barrido utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real iCycler iQ (Bio-Rad). Las muestras se prepararon a 0,5 mg/ml, en presencia o ausencia de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 5 o 10 mM como agente reductor, y se complementaron con 5x SYPRO Orange Protein Stain (Thermo Fisher Scientific). La temperatura de transición media (Tm) se determinó como el promedio de mediciones duplicadas del valor del punto medio de la curva de estabilidad.

Incubamos 10 μM del sustrato de proteína fluorescente DQ Red BSA (Thermo Fisher Scientific) con neprosina 0,15 μM en 100 μL de tampón a pH 2–8. La fluorescencia se controló utilizando un fluorímetro de microplacas Infinite M2000 (Tecan) a 37 °C. Probamos tripsina bovina 0,5 μM (Sigma-Aldrich) y pepsina porcina (Fluka) para comparar. Cada ensayo se llevó a cabo por triplicado.

Los parámetros cinéticos de la escisión del péptido FS6-QPQL (Mca–Q–P–Q–L–Dpa–A–R–NH2; GenScript) por la neprosina de tipo salvaje (concentración de enzima final de 25 nM), así como los del FS6 péptido (Mca–K–P–L–G–L–Dpa–A–R–NH2; Sigma-Aldrich) por neprosina a una concentración de enzima final de 100 nM, se determinaron en reacciones que contenían glicina 100 mM, pH 3,0 y concentraciones de sustrato de 1 –75 μM (FS6-QPQL) o 2,5–75 μM (FS6) a 37 °C. La señal de fluorescencia, que representa la formación del producto de escisión, se registró a lo largo del tiempo para cada concentración de sustrato y la tasa inicial (v0) se derivó de la pendiente de la parte lineal de la curva. Usando un rango de concentraciones de sustrato y un excedente de peptidasa, medimos la señal de fluorescencia generada después de la rotación total del sustrato y calculamos las unidades de fluorescencia correspondientes por picomol de sustrato dividido. Estos valores se representaron frente a la concentración de sustrato y se ajustaron a la ecuación hiperbólica de Michaelis-Menten (v = Vmax·[S]/{KM+[S]}) mediante regresión no lineal usando GraphPad75 y SigmaPlot76 para determinar la velocidad máxima (Vmax), la Michaelis la constante de afinidad del sustrato (KM), la tasa de rotación (kcat = Vmax/[Etotal]) y la eficiencia catalítica (kcat/KM) de la reacción de escisión. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.

La actividad peptidolítica de la neprosina de tipo salvaje se comparó con la de los mutantes K118A, H134A, Y136A, Q173A, W175A, E188Q, Y214A y E297Q (140 ng) usando 10 μM del péptido fluorogénico FS6-QPQL en glicina 100 mM pH 3.0 , cloruro de sodio 150 mM a 37 °C, agitando en un lector de microplacas Synergy H1 (BioTek). Para garantizar un tratamiento de muestra idéntico, todas las variantes de proteína se activaron con neprosin-strep, que luego se eliminó mediante cromatografía de afinidad inversa como se indicó anteriormente. La concentración de proteína se estimó a partir de la superficie de las curvas A280 SEC y se corrigió en función de los valores de ε280. Los valores de fluorescencia después de 30 min se usaron como puntos finales de actividad. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y las diferencias se analizaron para determinar la significación estadística usando GraphPad.

Se preparó gliadina de trigo (Sigma-Aldrich) en glicina 100 mM pH 2,5 y concentraciones variables de pepsina (0,05–10 μM) de mucosa gástrica porcina (Fluka), neprosina (0,05–2 μM) o mezclas de pepsina 0,5 μM y 0,05 –Se usaron neprosina 2 μM para digerir suspensiones de gliadina de 10 mg/mL. Las reacciones se monitorearon por turbidimetría en placas de 96 pocillos (Corning) a 37 °C en un espectrofotómetro de microplacas (BioTek). Las reacciones se extinguieron hirviéndolas en tampón de muestra SDS antes del análisis por SDS-PAGE. La degradación de gliadina por neprosina también se analizó mediante zimografía utilizando geles SDS-PAGE que contenían gliadina de trigo o gelatina de teleósteos (Sigma-Aldrich), que se utilizó como control, a 0,1 mg/ml. También se probó la pro-neprosina, que se activó a la forma madura durante el ensayo. Las proteínas se renaturalizaron lavando los zimogramas con Triton X-100 al 2,5 % en glicina 100 mM, pH 2,5, cloruro sódico 200 mM. Después de lavados adicionales con el mismo tampón más Brij-35 al 0,02 %, los zimogramas se incubaron durante la noche en el mismo tampón, se enjuagaron brevemente con agua y se tiñeron con Coomassie.

La escisión del péptido 33-mer de α-gliadina de trigo (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF, 3911 Da) se controló utilizando un espectrómetro de masas AutoFLEX III MALDI-TOF. El péptido (de GenScript) se disolvió en agua a una concentración de ~20 mg/mL y se almacenó a –20 °C. La reacción de escisión se llevó a cabo con ~1 mg/ml (~250 μM) de sustrato en glicina 100 mM, pH 3,0 a 37 °C, añadiendo neprosina 0,5 μM o pepsina 10 μM. Las reacciones se detuvieron en diferentes puntos de tiempo (0 min, 10 min, 20 min, 45 min, 1 h y toda la noche) y luego las muestras se diluyeron 1:10 con agua, se mezclaron con un volumen igual de la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico. a 10 mg/ml en una solución que contiene 30 % de acetonitrilo y 70 % de ácido trifluoroacético al 0,1 %, y se salpica sobre una placa de acero rectificada (Bruker). Los espectros de masas se adquirieron en modo de reflectrón positivo a un voltaje de aceleración total de 21 kV.

Volvimos a analizar los datos de especificidad de escisión de la neprosina endógena o material recombinante obtenido de Escherichia coli depositado en Chorus (Proyecto ID 126225). Los archivos sin procesar de LC-MS/MS se convirtieron al formato MGF y los datos se procesaron utilizando TANDEM, Comet y MS-GF+, tal como se implementó en SearchGUI77. Los resultados se evaluaron utilizando PeptideShaker78 con una tasa de detección falsa del 1 %. Se buscaron datos no específicos para aciertos contra el proteoma humano en UniProt (marzo de 2020) utilizando una tolerancia de masa de 20 ppm para MS1 y MS2, carbamidometilación de cisteína fija y oxidación de metionina variable. Se toleraron hasta 50 escisiones omitidas o un máximo de 5500 Da para la masa peptídica original.

En la búsqueda de inhibidores de la neprosina, ensayamos el cóctel inhibidor completo de amplio espectro (Roche); los inhibidores de metalopeptidasas 1,10-fenatrolina, fosforamidón, marimastat y captopril (todos de Sigma-Aldrich); el inhibidor de serina peptidasa fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilo (AEBSF; Sigma-Aldrich); los inhibidores de aspartato peptidasa pepstatina A (Sigma-Aldrich), 2-[(2-diazoacetil)amino]hexanoato de metilo (DAN; Chemical Abstracts Service (CAS) 7013-09-4; Bachem 4010441), y ENPN (CAS 5255- 75-4, Apollo Scientific OR26560); así como los compuestos que imitan/que contienen prolina 2-acetil-1-metilpirrol (AMP; CAS 932-16-1; Sigma-Aldrich 160865); (S)-terc-butil-2-(3-etoxi-3-oxopropanoil)pirrolidin-1-carboxilato (BEOPC; CAS 109180-95-2; Fluorochem 387901); y N-boc-glicilprolina (BGP; CAS 14296-92-5; Bachem 4003703). La inhibición de la escisión del péptido FS6-QPQL se investigó preincubando neprosina 100 nM en glicina 100 mM pH 3,0 con 100 μM de cada compuesto de prueba durante >1 hora a 37 °C. Luego agregamos 10 μM del sustrato y la actividad residual se controló durante 4 h como un aumento en la fluorescencia. Se analizó la significación estadística de las diferencias usando GraphPad. El control positivo en ausencia de inhibidores (100% de actividad) contenía la misma concentración final de dimetilsulfóxido que se usó para solubilizar los inhibidores. Además, se determinaron los valores de concentración inhibitoria media máxima (IC50) para pepstatina A y ENPN midiendo la actividad de neprosina 50 nM en presencia de 10 μM de sustrato y concentraciones de inhibidor de 5–500 μM y 5–5000 μM, respectivamente. , para obtener las curvas de inhibición. Estas curvas se analizaron mediante regresión no lineal usando GraphPad.

Los procedimientos experimentales con ratones siguieron las pautas institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y las pautas ARRIVE. Los protocolos fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Barcelona (CEEA-UB/Ref. 186/20-P2) y la Generalitat de Catalunya (PAMN/Ref. 11485), que siguieron la Directiva 2010/63/UE para la protección de los animales utilizados con fines científicos. El tamaño de la muestra fue estimado por el programa de la Oficina de Valoración de Proyectos de la Universitat Miguel Hernández de Elx (Alacant, España). Utilizamos ratones C57BL/6 machos y hembras de 5 semanas de edad (n = 16) comprados a Janvier y alojados en el animalario de la Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación de la Universidad de Barcelona en un ambiente controlado (20-24 ° C, 40–60 % de humedad relativa) y un fotoperíodo de 12 h, con luces encendidas a las 8 am y apagadas a las 8 pm Los animales se alojaron en jaulas con grandes partículas fibrosas de Souralit 1035 como ropa de cama (Bobadeb) y papel de seda (Gomà -Campamentos) y estructuras trepadoras de cartón para enriquecimiento de jaulas. Los animales tuvieron libre acceso al agua y a la dieta RM3 (P) SQC (Servicios de Dieta Especial).

Después de 1 semana de aclimatación, se seleccionaron al azar dos grupos de ratones, cada uno compuesto por cuatro machos y cuatro hembras (n = 8 por grupo) y se marcaron con neprosina (N) o vehículo (V). Los animales no estuvieron en ayunas para tener en cuenta el tiempo de tránsito fisiológico, y la comida y el agua se retiraron solo 1 h antes de la alimentación forzada oral. Los ratones del grupo N recibieron 50 μL de proneprosina en vehículo (0,2 mg/ml en solución salina tamponada con Tris 20 μM, pH 7,5, cloruro de sodio 150 μM), mientras que los ratones del grupo V recibieron 50 μL de vehículo solo. Después de 5 min, todos los ratones recibieron 50 μL de suspensión de gliadina que contenía 5 mg de gliadina de trigo (Sigma-Aldrich) a 100 mg/mL en una solución de etanol al 10 % usando jeringas Hamilton de pequeño volumen y sondas orales adaptadas. La proporción enzima:gliadina (1:500) se calculó en base a nuestros resultados in vitro, que habían demostrado que la neprosina digiere la gliadina en una proporción de 1:500–1000 a 37 °C durante un período de 90 min. Dado que el tránsito gastrointestinal en ratones provoca que un bolo llegue al intestino delgado después de 1 a 3 h, con algo de contenido que ya ingresa al intestino grueso79, seleccionamos 2,5 h como el criterio de valoración óptimo para evaluar la degradación de la gliadina en el tracto gastrointestinal superior. Luego, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y el contenido del estómago, el intestino delgado proximal y el intestino delgado distal se extrajeron, pesaron y congelaron a –20 °C.

Las muestras se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2) a una concentración de 200 mg/mL, se homogeneizaron con un Kimble Pellet Pester Cordless Motor (DWK Life Sciences) y se extrajeron primero con tampón a 50 °C durante 40 min y luego con Etanol al 80 % a 20–25 °C durante 1 h. Las mezclas se centrifugaron (2000 × g, 10 min, 4 °C) y se eliminó la capa acuosa entre las capas de partículas y grasa. El contenido de 33-mer en cada extracto diluido se analizó utilizando el kit de prueba AgraQuant Gluten G12 ELISA (Romer Labs), que tiene un límite de detección de 2 ppm, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo G12 detecta los fragmentos de degradación de gliadina de 33 unidades pero no otros80. Las cantidades finales se normalizaron teniendo en cuenta el peso de la muestra y los resultados se expresaron como media ± SEM. Para el análisis estadístico se utilizó el Paquete Estadístico para Ciencias Sociales (SPSS v22.0; IBM). Los datos mostraron homogeneidad de varianza (prueba de Levene) y siguieron una distribución normal (prueba de Shapiro-Wilk), por lo que se aplicó el análisis de varianza convencional de una vía (ANOVA).

Examinamos las condiciones de cristalización en la plataforma de cristalografía automatizada conjunta IBMB/IRB utilizando el método de difusión de vapor de gota sentada. Los cristales óptimos de proneprosina (~20 mg/ml en Tris·HCl 20 mM, pH 7,5, cloruro de sodio 150 mM) se obtuvieron a 20 °C con acetato de sodio 0,1 M, pH 4,0, polietilenglicol (PEG) 6000 al 22 %, 10 % isopropanol como solución reservorio. Los cristales se recolectaron utilizando crio-bucles (dimensiones moleculares), se pasaron rápidamente a través de un tampón criogénico que consiste en una solución de depósito más 15 % (v/v) de glicerol y se sometieron a vitrificación súbita en nitrógeno líquido para la recopilación de datos. Se obtuvo un derivado de lutecio de la pro-neprosina sumergiendo cristales nativos durante 5 min en tampón criogénico suplementado con 100 mM del cristalóforo Lu-Xo4 (Polyvalan)40 y sometiéndolos a vitrificación súbita sin sumergirlos. Los datos de difracción de rayos X se recopilaron de cristales nativos a 100 K en un detector de píxeles Pilatus 6M-F en la línea de luz I04-1 de Diamond Light Source (Harwell, Reino Unido). Los datos de derivados de lutecio se registraron en un detector Pilatus 6M en la línea de luz XALOC del sincrotrón ALBA (Cerdanyola, Cataluña, España) operado con el software Generic Data Acquisition (GDA).

El complejo de neprosina-producto maduro (forma cristalina I) se obtuvo a una concentración de proteína de ~16 mg/ml en Tris·HCl 20 mM, pH 7,5, cloruro de sodio 250 mM a 4 °C usando PEG 1000 al 10 %, PEG 8000 al 10 %. como la solución del yacimiento. Los cristales se crioprotegieron con la misma solución de depósito más glicerol al 15 % (v/v) antes de la vitrificación instantánea en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de rayos X a 100 K se recopilaron en la línea de luz ID30B del sincrotrón ESRF (Grenoble, Francia) utilizando un detector Pilatus 6M. El complejo maduro de neprosina-producto en forma de cristal II se obtuvo a la misma concentración de proteína pero en glicina 0,1 M pH 3,0, cloruro de sodio 150 mM a 20 °C usando citrato de sodio tribásico 0,1 M pH 5,6, sulfato de amonio 0,5 M, litio 1 M sulfato como solución reservorio. Los cristales se crioprotegieron con una solución que contenía glicerol al 20% (v/v). Los datos de difracción se recopilaron en la línea de luz XALOC en un detector Pilatus 6M.

Los datos de difracción se procesaron con Xds81 y Xscale, y se transformaron a formato MTZ con Xdsconv para los conjuntos de programas Phenix82 y Ccp483. Todos los cristales contenían un monómero en la unidad asimétrica de cristal y la Tabla complementaria 1 proporciona estadísticas esenciales sobre la recopilación y el procesamiento de datos.

La estructura de la pro-neprosina se resolvió mediante difracción anómala de longitud de onda única utilizando datos recopilados de un cristal derivado de lutecio en la longitud de onda máxima de absorción LIII (1,34 Å) mediante la aplicación del protocolo Autosol del paquete Phenix. El mapa de Fourier resultante se sometió luego a una mayor modificación de la densidad con wARP/ARP84. Se obtuvo un modelo inicial para Lu-Xo4 mediante la minimización de energía aplicada a las coordenadas del resto quelante de metales del compuesto que se encuentra en su complejo con Tb3+ (Banco de datos de proteínas [PDB] ID 6FRO, nombre de residuo 7MT) utilizando Chimera85. Las coordenadas resultantes en formato PDB se combinaron con un ion Lu3+ para la construcción de modelos. A partir de entonces, varias rondas de construcción manual de modelos en Coot86 se alternaron con el refinamiento cristalográfico utilizando el protocolo Refine de Phenix y el programa BUSTER87. El modelo final comprendía los residuos de proneprosina A29–Q380 excepto S76–Y85 y N122–N131 más tres residuos C-terminales adicionales de la etiqueta de purificación (A401–I402–A403); dos fracciones Lu-Xo4 a aproximadamente la mitad de la ocupación; dos cadenas de glucano unidas a N que suman un total de cinco residuos de azúcar unidos a N145 y N152, respectivamente; dos moléculas de acetato; y 180 moléculas de disolvente.

La estructura de la proneprosina nativa se resolvió mediante reemplazo molecular utilizando el software cristalográfico Phaser dentro de Ccp4 y las coordenadas de proteína de la estructura cristalina del derivado de lutecio. La construcción y el refinamiento posteriores del modelo procedieron como se describe anteriormente. El modelo final incluía los residuos A29–Q380 excepto Y77–Y85 y N122–N131 más dos residuos C-terminales adicionales de la etiqueta de purificación (A401–I402), dos cadenas de glucano unidas a N que suman cuatro residuos de azúcar, así como ocho residuos de acetato, un isopropanol, cuatro glicerol y 257 moléculas de disolvente.

La estructura de un complejo producto de neprosina madura nativa en forma de cristal I también se resolvió mediante reemplazo molecular, utilizando las coordenadas del fragmento T132–I402 de la proneprosina nativa. La construcción y el refinamiento posteriores del modelo procedieron como se describe anteriormente. El modelo final abarcó los residuos T132–Q380 más la etiqueta C-terminal completa (A401–I402–A403+H404–H409), dos cadenas de glucano unidas a N que suman un total de siete residuos de azúcar, más un trietilenglicol y 171 moléculas de solvente. La estructura de un complejo de producto de neprosina nativa madura en forma de cristal II también se resolvió mediante reemplazo molecular, utilizando el fragmento T132-Q380 del complejo de forma de cristal I. El modelo final incluía los residuos T132–Q380 más la etiqueta C-terminal excepto H409 (A401–I402–A403+H404–H408), así como dos cadenas de glucano unidas a N que suman un total de cuatro residuos de azúcar más un catión de níquel, tres aniones de sulfato, una tetraglicina y una glicina, así como 250 moléculas de disolvente. El ion de níquel, presumiblemente de la resina Ni-NTA utilizada para la purificación, se asignó tentativamente en función de distancias de ligando cortas a dos residuos de histidina (~1,8 Å), que estaban más cerca de los informados para los iones de níquel coordinados tetraédricamente (1,88 Å en promedio). ) que a las del litio más abundante (2,03 Å) de la solución del yacimiento88. Se colocó tentativamente una tetraglicina en una región de densidad adecuada con base en la capacidad de este aminoácido para oligomerizar bajo ciertas condiciones89. La Tabla complementaria 1 proporciona estadísticas esenciales sobre los modelos refinados finales, que se validaron mediante el servicio de validación de wwPDB en https://validate-rcsb-1.wwpdb.org/validservice y se depositaron en PDB en www.pdb.org (códigos de acceso 7ZU8, 7ZVA, 7ZVB y 7ZVC).

Las superposiciones estructurales y las alineaciones de secuencias basadas en la estructura se calcularon utilizando el programa SSM dentro de Coot. Las figuras se prepararon con Chimera. Las búsquedas de similitud basadas en la estructura se realizaron con Dali90. Las interfaces de proteínas se calcularon con PDBePISA en www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa. La superficie de interacción de un complejo se definió como la mitad de la suma de las áreas superficiales enterradas de cualquiera de las moléculas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos y reactivos están disponibles gratuitamente a los autores previa solicitud razonable y firma de acuerdos de confidencialidad y transferencia de material para uso sin fines de lucro por parte de grupos académicos. Los datos de origen se proporcionan con este documento. Las coordenadas atómicas están disponibles en Protein Data Bank con los códigos 7ZU8, 7ZVA, 7ZVB y 7ZVC. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Agradecemos a Laura Company, Roman Bonet, Xandra Kreplin y Joan Pous de la Plataforma conjunta de cristalografía automatizada IBMB/IRB y el Servicio de purificación de proteínas por su asistencia durante la purificación y la cristalización. El plásmido pCMV fue proporcionado amablemente por Jan J. Enghild, Universidad de Århus, Dinamarca. Los autores también desean agradecer a los sincrotrones ESRF, DIAMOND y ALBA por el tiempo de haz y al personal de la línea de haz respectivo por su asistencia durante la recopilación de datos de difracción. Este estudio ha sido financiado en parte por subvenciones de organismos públicos y privados españoles y catalanes (subvención/beca referencias PID2019-107725RG-I00 a FXG-R., ARB, UE y TG; BES-2016-076877 a SRM, BES-2015- 074583 a LAM, Beatriu de Pinós 2018BP00163 a UE, 2017SGR3 y Fundació La Marató de TV3 201815 a FXG-R., UE, ARB y TG). Los autores agradecen a Richard M. Twyman por editar el manuscrito.

Estos autores contribuyeron por igual: Laura del Amo-Maestro, Soraia R. Mendes.

Laboratorio de Proteólisis; Departamento de Biología Estructural, Instituto de Biología Molecular de Barcelona (CSIC), Parc Científic de Barcelona; c/Baldiri Reixac, 15-21, 08028, Barcelona, ​​Cataluña, España

Laura del Amo-Maestro, Soraia R. Mendes, Arturo Rodríguez-Banqueri, Laura Garzon-Flores, Tibisay Guevara, Ulrich Eckhard & F. Xavier Gomis-Rüth

Sección de Fisiología; Departamento de Bioquímica y Fisiología; Facultad de Farmacia y Bromatología, Universidad de Barcelona, ​​Av. Joan XXIII, 27-31, 08028, Barcelona, ​​Cataluña, España

Marina Girbal, María José Rodríguez-Lagunas, Ángeles Franch & Francisco J. Pérez-Cano

Research Institute of Nutrition and Food Safety (INSA-UB), University of Barcelona, Av. Prat de la Riba, 171, 08921, Santa Coloma de Gramenet, Catalonia, Spain

Marina Girbal, María José Rodríguez-Lagunas, Ángeles Franch & Francisco J. Pérez-Cano

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FXGR concibió y supervisó el proyecto; LdAM, TG, LG-F. y SRM produjo y purificó proteínas, generó mutantes y realizó estudios in vitro; proteínas cristalizadas LdAM, ARB y TG; ARB y UE recopilaron datos de difracción; UE realizó experimentos, analizó datos y supervisó a los trabajadores; Estructuras cristalinas resueltas y refinadas con FXGR; FJPC, MG, MJRL y À.F. realizó experimentos con animales, y FXGR escribió el manuscrito con contribuciones de todos los autores.

Correspondencia a F. Xavier Gomis-Rüth.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Hans Brandstetter y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

del Amo-Maestro , L. , Mendes , SR , Rodríguez-Banqueri , A. et al. Estudios moleculares e in vivo de una prolil-endopeptidasa de clase glutamato para la terapia de la enfermedad celíaca. Nat Comun 13, 4446 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32215-1

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Recibido: 16 mayo 2022

Aceptado: 21 de julio de 2022

Publicado: 01 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32215-1

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