Identificación y caracterización bioquímica de un nuevo N

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 16991 (2022) Citar este artículo

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La N-acetilglucosamina (GlcNAc) es un componente clave de los glicanos como la glicoproteína y la pared celular. La quinasa GlcNAc es una enzima que transfiere un fosfato a GlcNAc para generar GlcNAc-6-fosfato, que puede ser un precursor de la síntesis de glicanos. Las quinasas GlcNAc se han encontrado en una amplia gama de organismos, incluidas levaduras patógenas, humanos y bacterias. Sin embargo, esta enzima nunca se ha descubierto en Saccharomyces cerevisiae, un modelo eucariótico. En este estudio, se identificó la primera GlcNAc quinasa de S. cerevisiae y se denominó Ngk1. Los valores de Km de Ngk1 para GlcNAc y glucosa fueron 0,11 mM y 71 mM, respectivamente, lo que sugiere que Ngk1 posee una alta afinidad por GlcNAc, a diferencia de las hexocinasas. Ngk1 mostró la actividad de fosforilación de GlcNAc con varios nucleósidos trifosfatos, a saber, ATP, CTP, GTP, ITP y UTP, como donantes de fosforilo. Ngk1 está filogenéticamente distante de las enzimas conocidas, ya que la identidad de la secuencia de aminoácidos con otras es solo del 20% o menos. También se discute el papel fisiológico de Ngk1 en S. cerevisiae.

La N-acetilglucosamina (GlcNAc), un carbohidrato ubicuo tanto en procariotas como en eucariotas, es un componente esencial de los glucanos, como las N-glucoproteínas, los anclajes GPI y las paredes celulares, incluidos los peptidoglucanos de las bacterias y las quitinas de las levaduras1,2,3. Para la biosíntesis de glicanos, la uridina difosfato N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) es un sustrato esencial tanto en procariotas como en eucariotas porque el resto GlcNAc de este azúcar de nucleótido se incorpora a los glicanos mediante glicosiltransferasas2,3. En general, la UDP-GlcNAc se sintetiza a partir de la fructosa-6-fosfato (Fru-6-P), un intermediario de la glucólisis, que se puede convertir en glucosamina-6-P3. En eucariotas, la glucosamina-6-P se acetila para convertirse en GlcNAc-6-P, seguido de la isomerización en GlcNAc-1-P3. En procariotas, por otro lado, la glucosamina-6-P se isomeriza principalmente en glucosamina-1-P y luego se acetila para convertirse en GlcNAc-1-P3,4. En el paso final, GlcNAc-1-P se convierte en UDP-GlcNAc por uridilación tanto en procariotas como en eucariotas3,4.

GlcNAc quinasa (EC 2.7.1.59) es una enzima metabolizadora de GlcNAc descubierta en amplias especies de organismos, incluidas bacterias, levaduras patógenas, plantas y animales3,4,5,6,7,8. Esta enzima transfiere el grupo gamma-fosforilo de un ATP al grupo hidroxilo en el C-6 de GlcNAc para generar un GlcNAc-6-P. La quinasa GlcNAc está relacionada estructuralmente con la hexoquinasa (EC 2.7.1.1), que es otro tipo de azúcar quinasa que actúa preferentemente sobre la glucosa (Glc) para generar Glc-6-P en el primer paso de la glucólisis, ya que estas enzimas suelen tener una ATPasa dominio9,10. En los mamíferos, la GlcNAc cinasa se conoce como una enzima que proporciona una vía de recuperación de la biosíntesis de UDP-GlcNAc, ya que esta enzima produce GlcNAc-6-P, que puede ser un precursor de UDP-GlcNAc11. Por el contrario, se ha estudiado el papel de NagK, la GlcNAc quinasa de Escherichia coli, en la utilización de GlcNAc para la biosíntesis de Fru-6-P, ya que existe una vía inversa para convertir GlcNAc-6-P en Fru-6-P para la fuente de energía en la glucólisis4. De manera similar, también se identificó CaNag5, la GlcNAc quinasa de la levadura patógena Candida albicans, y se informó que está involucrada en la utilización de GlcNAc para generar Fru-6-P como fuente de energía3,5,6. Al igual que las bacterias, C. albicans puede crecer en GlcNAc como fuente de carbono. De hecho, existe una vía para convertir GlcNAc en Fru-6-P en C. albicans, porque el grupo de genes de las enzimas metabolizadoras de GlcNAc, que consiste en GlcNAc quinasa (CaNAG5), así como GlcNAc-6-P desacetilasa (CaNAG2) y La glucosamina-6-P desaminasa (CaNAG1) se identificó a partir de la similitud de secuencia con estas enzimas de E. coli4. Se demostró que la alteración de estos genes retardaba el crecimiento de C. albicans en GlcNAc como fuente de carbono.

A diferencia de C. albicans, la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae no crece en GlcNAc como fuente de carbono3,5,6. Además, cualquier gen similar a CaNAG5, CaNAG2 o CaNAG1 no se conserva en el genoma completo de S. cerevisiae6. Por lo tanto, se ha considerado que S. cerevisiae no posee estas enzimas metabolizadoras de GlcNAc. En S. cerevisiae, la presencia de tres hexocinasas, Hxk1, Hxk2 y Glk1, se conoce desde la década de 198012. Durante varias décadas se ha creído que S. cerevisiae no posee otra hexocinasa distinta de Hxk1, Hxk2 y Glk1. Sin embargo, hemos notado y nos hemos centrado en la presencia de otros dos genes tipo hexoquinasa (pero cuyas funciones se desconocían): EMI2 e YLR446W. En nuestro trabajo anterior, la proteína Emi2 se identificó como una cuarta hexocinasa nueva de S. cerevisiae además de las conocidas anteriormente: Hxk1, Hxk2 y Glk113. En este estudio, nos enfocamos en otro gen similar a la hexoquinasa, YLR446W (nombre sistemático), que no tiene un nombre de gen estándar, para examinar si es una nueva hexoquinasa adicional en este organismo modelo. Inesperadamente, descubrimos que YLR446W codifica una nueva quinasa GlcNAc que muestra una similitud de secuencia baja con las quinasas GlcNAc conocidas de otros organismos.

El gen YLR446W es un gen de función desconocida que codifica una proteína de 433 aminoácidos y tiene un dominio ATPasa tipo hexoquinasa. Una búsqueda de homología no encontró ninguna enzima de función conocida que tuviera una gran similitud con la proteína codificada por el gen YLR446W (YLR446Wp). Sin embargo, YLR446Wp tiene una identidad de secuencia de aproximadamente el 20 % con Hxk1, Hxk2, Glk1 y Emi2 de S. cerevisiae (Fig. S1 complementaria). Además, se predijo que este producto génico sería de aproximadamente 50 kDa de una proteína citosólica que no tiene secuencia de péptido señal, como es el caso de Hxk1, Hxk2, Glk1 y Emi29,13. Por lo tanto, comenzamos a examinar si este gen codifica una hexoquinasa. El YLR446Wp recombinante se expresó en células de E. coli y se purificó para su uso en un ensayo enzimático (datos no mostrados).

Por lo general, el ATP puede ser un donante de fosforilo para la hexocinasa al formar un complejo con cationes divalentes, como Mg2+. Se encontró que YLR446Wp mostró una baja actividad de fosforilación de glucosa (0.010 U/mg) en presencia de ATP y Mg2+ (Fig. 1a). Los niveles relativos de actividad de la fosforilación de glucosa en presencia de ATP y de Mg2+, Co2+ o Mn2+ fueron del 100 %, 170 % y 80 %, respectivamente (Fig. 1b), lo que sugiere que Mg2+ puede sustituirse por Co2+ o Mn2+. Por otro lado, la actividad enzimática apenas se detectó en presencia de Ca2+ o Zn2+. En ausencia de cationes divalentes, la actividad enzimática no se observó en presencia de ATP (Fig. 1a yb). Estos resultados mostraron que YLR446Wp es una quinasa que actúa sobre Glc, con un requerimiento de cationes divalentes, similar al caso de las hexoquinasas conocidas13. También se encontró que la actividad de glucocinasa de esta enzima en presencia de Glc 10 mM fue menor que la de las otras cuatro hexocinasas, cuyos valores fueron 0.044–180 mU para Hxk1, Hxk2, Glk1 y Emi2 en nuestras condiciones de ensayo. Aunque la actividad más alta de YLR446Wp se observó en presencia de Co2+, solo se detectó una pequeña cantidad de Co2+ intracelular14. Por otro lado, el Mg2+ abunda en las células de levadura y es conocido como un cofactor importante para las quinasas dependientes de ATP15. Por lo tanto, decidimos realizar el ensayo enzimático en presencia de Mg2+ en los experimentos posteriores.

Ensayo de la actividad de fosforilación de Glc de YLR446Wp. ( a ) La actividad enzimática de YLR446Wp para la fosforilación de glucosa se controló mediante un ensayo acoplado de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. La reacción de fosforilación de glucosa con Ngk1 se evaluó en presencia (+) o ausencia (-) de MgCl2. (b) Se comparó la actividad específica para la fosforilación de glucosa en presencia de MgCl2, CoCl2, MnCl2, ZnCl2, CaCl2 o EDTA. El porcentaje de actividad específica en presencia de MgCl2 se fijó en 100%. Barras de error, la desviación estándar de dos experimentos independientes.

La mayoría de las hexocinasas conocidas, incluidas Hxk1, Hxk2 y Emi2, pueden actuar no solo sobre la glucosa, sino también sobre la manosa, la fructosa y la glucosamina13,16. Examinamos si YLR446Wp puede fosforilar monosacáridos distintos de la glucosa al monitorear el producto de reacción por TLC. El producto de fosforilación apenas se detectó cuando se utilizó fructosa, manosa o galactosa como sustrato de azúcar, lo que sugiere que esta enzima no reconoce estos monosacáridos como sustrato. En contraste, esta enzima demuestra la actividad de fosforilación en GlcNAc, ya que el producto de fosforilación se generó con una disminución en el sustrato de azúcar después de una reacción de 30 min (Fig. 2a). También se examinó la fosforilación de otros aminoazúcares, glucosamina, N'N'-diacetilquitobiosa, UDP-GlcNAc, N-acetilmanosamina y N-acetilgalactosamina para encontrar que esta enzima no muestra actividad detectable en estos aminoazúcares distintos de GlcNAc (Fig. 2b). En contraste, ninguna de las otras hexoquinasas de levadura, Hxk1, Hxk2, Glk1 y Emi2, mostró actividad detectable en GlcNAc (Fig. S2 complementaria). Por otro lado, todas estas hexoquinasas exhibieron claramente la actividad para Glc.

Análisis TLC de la especificidad del sustrato de azúcar de YLR446Wp. La especificidad de sustrato de la enzima para monosacáridos (a) y aminoazúcares (b) se controló mediante TLC. Una reacción que contiene ATP, MgCl2 y cada uno de los siguientes azúcares: GlcNAc, Glc, fructosa (Fru), manosa (Man), galactosa (Gal), glucosamina (GlcN), N'N'-diacetilquitobiosa (GlcNAc2), UDP- Se llevó a cabo GlcNAc, N-acetilmanosamina (ManNAc) o N-acetilgalactosamina (GalNAc) durante 30 min con (+) o sin (-) enzima. Se aplicó Glc-6-P o GlcNAc-6-P (15 nmol cada uno) a la placa de TLC como compuesto estándar. S, sustratos de azúcar; P, productos.

Para confirmar que YLR446Wp posee actividad GlcNAc quinasa, el producto de reacción se analizó por HPLC. Después de 3 h de reacción con la enzima, el pico de GlcNAc (S: RT = 4,19 min) disminuyó y fue reemplazado en gran medida por el producto (P: RT = 10,39 min) (Fig. 3a y b). El tiempo de retención del producto de reacción (P) se igualó esencialmente al de GlcNAc-6-P. Se observa que GlcNAc-1-P, otro fosfato de GlcNAc, se eluyó a los 9,87 min en las mismas condiciones (datos no mostrados). Además, la espectrometría ESI-MS mostró que la masa molecular del producto de reacción (P: RT = 10,39 min) coincidía con la masa calculada de GlcNAc-6-P [m/z [M − H]− 300]. Estos resultados sugieren que YLR446Wp posee actividad GlcNAc quinasa para generar GlcNAc-6-P, a diferencia de las otras hexoquinasas conocidas en S. cerevisiae.

Análisis HPLC de productos de fosforilación de GlcNAc. La mezcla de reacción en ausencia (a) o presencia (b) de la enzima, que comprende GlcNAc 10 mM, ATP 10 mM y MgCl2 10 mM, se llevó a cabo en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) a 30 °C durante 3 hy analizado por HPLC. El tiempo de retención de cada pico detectado a UV = 205 nm se igualó al de los compuestos estándar: S, GlcNAc (4,2 min); P, GlcNAc-6-P (10,4 min); ADP (12,4 minutos); *, Tris (4,7 minutos).

Los parámetros cinéticos para GlcNAc y Glc se compararon monitoreando la generación de ADP por la fosforilación de azúcar dependiente de ATP, mediante el uso del ensayo acoplado de piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa. Antes del ensayo, confirmamos que la actividad enzimática máxima se obtuvo alrededor de un pH de 8,0 utilizando el tampón Tris-HCl. Los valores de Km para GlcNAc y Glc se determinaron como 0,11 mM y 71 mM, respectivamente, lo que indica que la afinidad de esta quinasa por GlcNAc es aproximadamente 500 veces mayor que la de Glc (Fig. 4a yb). Sin embargo, las tasas de recambio de estos azúcares no fueron significativamente diferentes: los valores de kcat para GlcNAc y Glc fueron 2,3 s-1 y 1,1 s-1, respectivamente. Los valores de Km y kcat de Ngk1 para ATP, con el uso de GlcNAc como sustrato de azúcar, se determinaron como 1,2 mM y 3,4 s-1, respectivamente (datos no mostrados). Se informó que los valores de Km de las otras cuatro hexocinasas de S. cerevisiae para la fosforilación de glucosa eran inferiores a 0,20 mM (0,011–0,20 mM), mientras que los valores de kcat de estas enzimas cruzaron un amplio rango (0,042–63 s−1)13 ,dieciséis. A partir de estos resultados, hemos concluido que YLR446W no codifica una hexocinasa típica, pero codifica una nueva azúcar cinasa que es específica de GlcNAc y que nunca se ha identificado en S. cerevisiae. En consecuencia, llamamos a este gen NGK1, por N-acetilglucosamina quinasa 1.

YLR446W codifica una quinasa GlcNAc llamada Ngk1. El análisis cinético de la actividad quinasa Ngk1 de GlcNAc (a) y Glc (b) se llevó a cabo utilizando un ensayo acoplado de piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa.

Hay poco conocimiento sobre la reactividad de las GlcNAc quinasas en los nucleósidos trifosfato distintos del ATP. Se informó que las células de levadura contienen trifosfatos de nucleósidos que no son ATP, CTP, GTP, ITP y UTP17. Por lo tanto, examinamos la actividad de Ngk1 con cada uno de estos nucleósidos trifosfatos como donante de fosforilo. El producto de fosforilación se observó usando cualquier nucleósido trifosfato, incluidos ATP, GTP, CTP, ITP y UTP, después de la reacción con Ngk1 (Fig. 5a). Las actividades relativas contra GTP, CTP, ITP y UTP fueron del 15 %, 10 %, 41 % y 25 %, respectivamente, en comparación con ATP (Fig. 5b). El tiempo de retención de cada producto en HPLC fue consistente con el de GlcNAc-6-P (datos no mostrados). Estos datos sugieren que Ngk1 puede utilizar amplias especies de nucleósidos trifosfatos para generar GlcNAc-6-P.

Análisis de la reactividad de Ngk1 a diferentes nucleósidos trifosfatos. Se determinó la actividad Ngk1 de la fosforilación de GlcNAc utilizando ATP, GTP, CTP, ITP o UTP como donante de fosforilo. (a) Análisis TLC de la reacción (40 min) con (+) o sin (-) enzima. S, sustratos de azúcar; P, productos. (b) Las actividades específicas se determinaron midiendo la concentración de GlcNAc-6-P usando HPLC después de la reacción (20 min) con diferentes nucleósidos trifosfatos. La actividad específica de Ngk1 contra ATP se fijó en 100%. Barras de error, la desviación estándar de dos experimentos independientes.

Fue difícil alinear la secuencia de Ngk1 con las quinasas GlcNAc de la estructura primaria conocida (p. ej., quinasas GlcNAc humanas y bacterianas) debido a sus identidades de secuencia bajas (menos del 15%). Dado que se supone que la quinasa GlcNAc sería funcional y estructuralmente similar a las hexoquinasas, buscamos posibles residuos de aminoácidos involucrados en la reacción mediante la alineación con las hexoquinasas conocidas de S. cerevisiae (Fig. S1 complementaria). Entre ellos, las relaciones estructura-función de Hxk2 han sido bien estudiadas18. La alineación múltiple indicó que Asp-196 y Lys-152 de Ngk1 pueden ser los residuos putativos catalíticos y de unión a ATP, respectivamente. El reemplazo de Asp-196 o Lys-152 por Ala (D196A o K152A) disminuyó severamente la actividad enzimática (Fig. S3 complementaria). D196E todavía representó una parte de la actividad enzimática, mientras que D196A y D196N no mostraron actividad detectable después de la reacción durante la noche. Estos resultados sugieren que los residuos cruciales para la catálisis enzimática pueden conservarse en Ngk1, mientras que la identidad global de Ngk1 con otras hexocinasas de S. cerevisiae es solo de alrededor del 20 %.

El análisis filogenético muestra que Ngk1 está distante de otras quinasas GlcNAc conocidas así como de hexoquinasas (Fig. 6). Entre las enzimas conocidas, la GlcNAc quinasa de C. albicans (Ca.NAG5) fue la más cercana a Ngk1, aunque la identidad de secuencia de aminoácidos entre ellas es solo del 22%. Otras GlcNAc quinasas conocidas tanto de eucariotas superiores (Hs.NAGK y At.GNK, de humanos y Arabidopsis thaliana, respectivamente) como de bacterias4 (Ec.NagK de E. coli) estaban obviamente lejos de S. cerevisiae Ngk1 ya que sus secuencias se identifican con Ngk1 fueron menos del 15%. Se destaca que genes similares a Ngk1 se conservan como proteínas hipotéticas en levaduras de la familia Saccharomycetaceae, como Zygosaccharomyces rouxii (Zr. Hypothetical protein, 41% idéntica a Ngk1), aunque ninguna de ellas ha sido caracterizada.

Análisis filogenético de Ngk1 con GlcNAc quinasas y hexoquinasas. Árbol filogenético de GlcNAc quinasas y hexoquinasas identificadas o putativas. Los siguientes árboles filogenéticos se generaron utilizando Clustal Omega19 y se visualizaron con Dendroscope 320. Ngk1 y hexocinasas de S. cerevisiae: Sc.Unch(Ngk1)(AAT92658.1), Sc.Hxk1(NP_116711.3), Sc.Hxk2(NP_011261). 1). ), Sc.Glk1 (NP_009890.1), Sc.Emi2 (NP_010804.3). GlcNAc quinasas de C. albicans (Ca.NAG5, BAB43816.1), humana (Hs.NAGK, EAW99780.1), E. coli (Ec.NagK, NP_415637), Salmonella enterica (Se.NagK, EDN6582917.1), Arabidopsis thaliana (At.GNK, NP_564358.1), Eutrema salsugineum (Es.NAGK, XP_006415457.1) y Gorilla gorilla gorilla (Gg.NAGK, XP_018876635.1). N-acetilmanosamina quinasas de Staphylococcus aureus (Sa.ROK, WP_000291445.1) y Staphylococcus pseudintermedius (Sp.ROK, WP_214533982.1). Hexocinasas de eucariotas superiores, humanos (Hs.HKDC1, NP_079406.4), Arabidopsis thaliana (At.Hexokinase1, NP_194642.1) y Danio rerio (Dr.Hexokinase-2, NP_998231.1). Proteínas hipotéticas de Candida tropicalis (Ct. Proteína hipotética, XP_002549429.1) y Zygosaccharomyces rouxii (Zr. Proteína hipotética, GAV52624.1).

En este estudio, identificamos la primera GlcNAc quinasa de S. cerevisiae, un organismo modelo eucariótico. Hasta ahora, las cinasas GlcNAc se han identificado a partir de una amplia gama de organismos, incluidas bacterias y animales. Sin embargo, se ha pensado que S. cerevisiae no tiene GlcNAc quinasa, ya que no existe un gen similar a las GlcNAc quinasas conocidas en todo el genoma. De hecho, no pudimos predecir que el gen YLR446W sin nombre y de función desconocida de S. cerevisiae es un gen de la quinasa GlcNAc de la secuencia de aminoácidos porque la similitud de secuencia con las quinasas GlcNAc conocidas es de aproximadamente el 20% o menos. Aquí, determinamos la propiedad bioquímica de YLR446Wp y descubrimos que este gen codifica una quinasa GlcNAc y, por lo tanto, lo llamamos Ngk1.

Nuestro análisis enzimático mostró que Ngk1 posee actividad quinasa tanto para GlcNAc como para Glc, aunque los valores de Km para GlcNAc y Glc fueron 0, 11 mM y 71 mM, respectivamente (Fig. 4a, b). Teniendo en cuenta que la concentración de glucosa intracelular en las células de S. cerevisiae se estima en ~ 1,5 mM21, es posible que Ngk1 no participe en la fosforilación de la glucosa en las condiciones fisiológicas. Hay algunos informes sobre análisis bioquímicos de GlcNAc quinasas de otros organismos; se informó que los valores Km de las quinasas GlcNAc de C. albicans y humanos eran 0,38 mM y 0,45 mM, respectivamente6,8. Por lo tanto, la afinidad de Ngk1 por GlcNAc es mayor que la de otras GlcNAc quinasas. Ngk1 no mostró actividad quinasa para ningún azúcar, excepto para GlcNAc y Glc (Fig. 2a, b). La GlcNAc quinasa humana actúa tanto sobre ManNAc como sobre Glc, aunque en menor medida que GlcNAc8. Por otro lado, C. albicans Nag5 tiene actividad parcial para Glc y manosa pero no para ManNAc6. Ngk1 mostró la actividad con cualquier azúcar de nucleótido, por ejemplo, GTP, CTP, ITP y UTP (Fig. 5a), lo que sugiere que Ngk1 puede utilizar una amplia gama de nucleósidos trifosfatos como donantes de fosforilo. Aunque hay pocos informes sobre la reactividad de las azúcares quinasas para varios nucleósidos trifosfatos, se informó que CaNag5 no mostró actividad quinasa con estos azúcares de nucleótidos excepto para ATP y CTP5. En conjunto, estos resultados sugieren que la propiedad enzimática de las quinasas GlcNAc es diferente de las de su especie. Las quinasas GlcNAc de diferentes especies están filogenéticamente distantes, mientras que las hexoquinasas de diferentes especies están relativamente cerca (Fig. 6). Por lo tanto, las quinasas GlcNAc de diferentes especies pueden derivar de orígenes distantes y evolucionar de manera única. En particular, los genes similares a Ngk1 se conservan en diferentes géneros de hongos, por ejemplo, Z. rouxii, como proteínas desconocidas hipotéticas o funcionales. Ngk1 de S. cerevisiae puede ser una pista para el descubrimiento de un nuevo grupo de quinasas GlcNAc.

La importancia fisiológica de las quinasas GlcNAc es oscura, aunque esta enzima se ha encontrado en una amplia gama de organismos, desde bacterias hasta humanos. En C. albicans, se informó que la interrupción de Nag5 provocó una atenuación de su virulencia en ratones, así como una reducción en el crecimiento en medio GlcNAc6. Se supone que las GlcNAc quinasas de los mamíferos proporcionan una vía de recuperación para la síntesis de UDP-GlcNAc al fosforilar la GlcNAc intracelular que puede derivarse de los lisosomas11, pero se ha informado poca evidencia experimental. En E. coli, se sabe que NagK desempeña un papel en la utilización de GlcNAc intracelular derivada de la degradación de la mureína de la pared celular, ya que la GlcNAc extracelular se fosforila durante su transporte a las células4. Al menos, es posible que Ngk1 de S. cerevisiae no contribuya al metabolismo de GlcNAc para la glucólisis, ya que este organismo no crece utilizando GlcNAc extracelular como fuente de carbono5. Una posibilidad es que Ngk1 pueda contribuir a la biosíntesis de UDP-GlcNAc mediante la fosforilación de GlcNAc en la célula. Sin embargo, todavía es incierto que la GlcNAc libre intracelular pueda existir tanto desde el exterior como desde el interior de las células porque no se han identificado en este organismo vías para suministrar GlcNAc intracelular. Presumiblemente, Ngk1 puede ser prescindible para las células en crecimiento vegetativo en presencia de suficiente glucosa porque UDP-GlcNAc se sintetiza a partir de Fru-6-P a través de la vía conocida. De hecho, las células de levadura que carecen de Ngk1 crecieron normalmente en presencia de suficiente glucosa (datos no mostrados). Dado que un transcriptoma de todo el genoma sugirió que la transcripción de este gen aumenta durante la esporulación y la respuesta de la proteína desplegada22,23, Ngk1 puede desempeñar un papel bajo ciertas condiciones como una vía de suministro alternativa GlcNAc-6-P como precursor de UDP- GlcNAc. Se están realizando análisis para dilucidar el papel fisiológico de Ngk1 en S. cerevisiae.

Un fragmento de ADN de longitud completa de la región ORF de YLR446W se amplificó mediante PCR usando el ADN genómico de la cepa BY4742 de S. cerevisiae (Invitrogen, Waltham, MA, EE. 3'; inversa: 5'-ATTTATCTCGAGTTATTGAACTTGGTTGTCTGATTTGTTCAAGTAGGTG-3'). El fragmento de ADN amplificado se digirió con Nde I y Xho I y se ligó en los sitios correspondientes de un vector pCold II (Takara Bio, Shiga, Japón) para fusionarlo con una etiqueta His6 en el extremo N. La secuencia de nucleótidos del plásmido resultante (pColdII-His6-Ngk1) se confirmó mediante secuenciación de ADN. Luego, E. coli BL21 (DE3) se transformó con pColdII-His6-Ngk1 y la proteína recombinante se expresó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se recolectaron y sonicaron en hielo en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 150 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y ditiotreitol 1 mM. El extracto libre de células se aplicó a una columna HisTrap™ HP (GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.) y la proteína se purificó de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración de proteína se midió utilizando una solución CBB de ensayo de proteínas (Nacalai Tesque, Kioto, Japón). Las proteínas recombinantes de Hxk1, Hxk2, Glk1 y Emi2 se prepararon como se informó anteriormente13.

La mutagénesis dirigida al sitio de Ngk1 se llevó a cabo mediante PCR usando pColdII-His6-Ngk1 como plantilla y los cebadores de oligonucleótidos enumerados en la Tabla S1 complementaria, de acuerdo con el procedimiento descrito para el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene, Alemania). La mutación de cada plásmido se confirmó mediante secuenciación de ADN. Usando los plásmidos resultantes, cada enzima mutante de Ngk1 se expresó en E. coli BL21 (DE3) y se usó para el ensayo enzimático después de la purificación, como se describió anteriormente para la enzima de tipo salvaje.

La medición de la actividad glucoquinasa de Ngk1 se realizó mediante la reacción de acoplamiento de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Oriental Yeast, Tokio, Japón) con la conversión de NAD+ en NADH13,24. La mezcla de ensayo comprendía glucosa 10 mM, ATP 5 mM, MgCl2 5 mM, NAD+ 2 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 1,6 U/ml y una cantidad adecuada de la enzima. Para examinar el efecto de los cationes divalentes, se reemplazó MgCl2 5 mM por cualquiera de la misma concentración de CoCl2, MnCl2, ZnCl2, CaCl2 o por EDTA 1 mM. La reacción a 30 °C se inició mediante la adición de la enzima y luego se controló el aumento de la absorbancia a 340 nm para la producción de NADH. Una unidad (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza la fosforilación de 1 μmol de Glc por minuto a 30 °C.

Para examinar la especificidad de sustrato de la enzima para diferentes azúcares, una reacción que comprende azúcar 10 mM (ya sea de GlcNAc, glucosa, manosa, fructosa, galactosa, glucosamina, N-acetilmanosamina, UDP-GlcNAc o N'N'-diacetilquitobiosa), 10 ATP mM y MgCl2 10 mM se llevó a cabo a 30 °C en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) con o sin enzima durante el tiempo indicado. Para los ensayos enzimáticos con diferentes nucleósidos trifosfatos como donantes de fosforilo, el ATP se reemplazó por nucleósidos trifosfatos (GTP, CTP, ITP o UTP) utilizando GlcNAc como sustrato de azúcar. La reacción se detuvo calentando a 100 °C durante 3 min. Los productos de reacción se analizaron por TLC y HPLC. Una unidad (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza la fosforilación de 1 μmol de GlcNAc por minuto a 30 °C.

Se colocó una muestra (3 µL) en una placa TLC de gel de sílice 60 F254 (Merck, Darmstadt, Alemania). La placa se reveló en 1-butanol/ácido acético/agua (8/3/2), se secó y se empapó en un reactivo de color (difenilamina al 2 %, anilina al 2 % y ácido fosfórico al 85 %) antes de hornear a 100 °C. durante 10 min. Se usaron Glc-6-P, GlcNAc-6-P y GlcNAc comerciales como estándares.

Los productos de reacción se analizaron por HPLC utilizando una columna COSMOSIL HILIC (Nacalai Tesque, Japón) y un detector UV a 205 nm. Se utilizó una mezcla de tampón de fosfato de sodio (10 mM, pH 7,0) y acetonitrilo (40:60, v/v) como fase móvil a un caudal de 1,0 ml/min y la temperatura de la columna se fijó en 30 °C. . Se usaron GlcNAc, GlcNAc-6-P, GlcNAc-1-P, ADP y Tris comerciales como estándares. Se cuantificó GlcNAc-6-P a partir de las áreas de los picos integrados. También se llevó a cabo ESI-MS para determinar la masa de la molécula que se supone que es GlcNAc-6-P en los productos de reacción utilizando un espectrómetro de masas LCMS-2010EV (Shimadzu, Kioto, Japón).

Para determinar los parámetros cinéticos, se midió la cantidad de ADP formado por la fosforilación del azúcar mediante un ensayo acoplado de piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa, como se estableció previamente13,24. La mezcla de ensayo comprendía de seis a siete concentraciones diferentes de GlcNAc (0,031–2,0 mM) o glucosa (7,3–500 mM) como sustrato de azúcar, ATP 5 mM, MgCl2 5 mM, fosfoenolpiruvato 5 mM, NADH 0,3 mM, Tris– HCl (pH 8,0), 18 U/mL de piruvato quinasa (Levadura Oriental, Japón), 20 U/mL de lactato deshidrogenasa (Levadura Oriental, Japón) y una cantidad adecuada de Ngk1. La reacción a 30 °C se inició agregando Ngk1 y siguió monitoreando la disminución de NADH en absorbancia a 340 nm. Los valores de Km y kcat se determinaron mediante análisis de regresión no lineal con el software Origin (OriginLab, Northampton, MA, EE. UU.).

Los conjuntos de datos generados y/o analizados en este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Fructosa

Glucosa

N-acetilglucosamina

1-fosfato

6-fosfato

Uridina difosfato N-acetilglucosamina

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Agradecemos al Dr. Hirotaka Katsuzaki (Mie University) por el análisis de la EM. También agradecemos a Riki Mizuta por el soporte técnico. Este trabajo fue apoyado financieramente por JSPS KAKENHI No. 22K05380 y en parte por el Instituto de Fermentación, Osaka (Japón) (Subvención No. G-2022-2-009).

Escuela de Graduados en Biorecursos, Universidad de Mie, Tsu, 514-8507, Japón

Midori Umekawa, Ayano Nishikawa, Naoto Isono y Shuichi Karita

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MU concibió los experimentos y escribió el manuscrito; NI revisó el manuscrito; MU, AN y NI realizaron los experimentos; MU y SK analizaron los resultados. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Midori Umekawa.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Umekawa, M., Nishikawa, A., Isono, N. et al. Identificación y caracterización bioquímica de una nueva N-acetilglucosamina quinasa en Saccharomyces cerevisiae. Informe científico 12, 16991 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21400-3

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Recibido: 09 junio 2022

Aceptado: 27 de septiembre de 2022

Publicado: 10 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21400-3

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