Las composiciones de la alfombra microbiana y los patrones de localización explican la virulencia de la enfermedad de la banda negra en los corales

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 15 (2023) Citar este artículo

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La enfermedad de la banda negra (BBD, por sus siglas en inglés) en los corales se caracteriza por una alfombra microbiana distintiva en forma de banda, que se propaga a través de los tejidos y, a menudo, mata las colonias infectadas. La capa microbiana está dominada por cianobacterias, pero también contiene comúnmente bacterias oxidantes de sulfuro (SOB), bacterias reductoras de sulfato (SRB) y otros microbios. La tasa de migración en BBD varía según las diferentes condiciones ambientales, incluida la temperatura, la luz y el pH. Sin embargo, aún se desconoce si las variaciones en las tasas de migración reflejan diferencias en el consorcio microbiano dentro de la estera BBD. Aquí, mostramos que la estructura de la superficie a microescala, la composición bacteriana y la distribución espacial diferían entre las lesiones BBD con diferentes tasas de migración. La tasa de migración se correlacionó positivamente con la abundancia relativa de SOB potenciales pertenecientes a Arcobacteraceae localizados en la capa media dentro de la alfombra y se correlacionó negativamente con la abundancia relativa de otros SOB potenciales pertenecientes a Rhodobacteraceae. Nuestro estudio destaca la composición microbiana en BBD como un importante determinante de la virulencia.

Las cianobacterias suelen ser organismos clave que forman tapetes microbianos en entornos naturales. Una característica llamativa del tapete de cianobacterias es su estructura estratificada y capas específicas en las que se distribuyen diferentes microorganismos tróficos1. Las capas superiores generalmente están dominadas por cianobacterias aerobias, diatomeas y otros fotótrofos oxigénicos, mientras que las capas inferiores están dominadas por varias bacterias anaerobias. Los mantos de cianobacterias se encuentran en ambientes terrestres y acuáticos, como planicies de arena intermareales, estanques hipersalinos, aguas termales, zonas intermareales y arrecifes de coral1,2,3. Las distribuciones verticales de bacterias pueden fluctuar diariamente4, y las esteras pueden expandirse horizontalmente en direcciones radiales5.

La enfermedad de la banda negra del coral (BBD, por sus siglas en inglés), caracterizada por una estera microbiana oscura dominada por cianobacterias, exhibe una forma de banda única que migra linealmente a través de los tejidos vivos del coral (Fig. 1). La banda negra característica migra sobre los tejidos vivos del coral, lo que provoca la lisis y la necrosis del tejido subyacente y deja un esqueleto de coral desnudo6. El ancho de la banda negra entre el tejido de coral aparentemente normal y el esqueleto recién expuesto puede variar desde unos pocos milímetros hasta siete centímetros7,8. La tasa de migración de BBD, registrada hasta 2 cm/día9, varía con la temperatura10,11, la luz10,11, el pH12 y las diferentes condiciones geográficas13. Al mismo tiempo, se produjeron hasta cinco diferencias en la tasa de migración dentro de un mismo arrecife14.

Representante BBD sobre el encierro de Montipora sp. colonia (a). Primer plano de la interfaz que muestra una banda negra, que estaba compuesta por una capa de cianobacterias entre el tejido de coral vivo (región sana) y el esqueleto de coral blanco expuesto (esqueleto desnudo) (b).

La biomasa de los tapetes polimicrobianos está dominada por los géneros de cianobacterias filamentosas Oscillatoria, Roseofilum y Pseudoscillatoria que se identificaron en el Indo-Pacífico, el Caribe y el Mar Rojo, respectivamente15. Esas cianobacterias pertenecen a un linaje monofilético y se encuentran constantemente en las lesiones de BBD, lo que indica su papel fundamental en la etiología de BBD15. Otros constituyentes microbianos comunes de la lesión de BBD son SOB (p. ej., Beggiatoa spp16 y Rhodobacterales17), SRB (p. ej., Desulfovibrio18 y Desulfobacteraceae19), algunas bacterias heterótrofas diversas15 y arqueas20. Las cianobacterias se ubican en la parte superior del tapete microbiano; SOB, SRB y bacterias heterótrofas se encuentran en la parte inferior durante el día; y las bacterias aeróbicas, incluida la SOB, se desplazan sobre la capa de cianobacterias durante la noche15. Se ha propuesto un mecanismo para esta distribución especial. La actividad de las cianobacterias durante el día da como resultado un microgradiente vertical dinámico de oxígeno8,21. Durante la noche, se forma un ambiente con un mínimo de oxígeno dentro de la alfombra y luego las SRB proliferan y se activan en las condiciones anóxicas debajo de la alfombra8. La privación de oxígeno y las altas concentraciones de sulfuro de SRB son fatales para el tejido coralino y, por lo tanto, se consideran los factores más importantes en la etiología de BBD15,22. Las toxinas de las cianobacterias también se han implicado en la necrosis del tejido coralino en el frente de la lesión en algunos estudios23. Mientras tanto, los miembros de SOB en BBD son inexplicables hasta ahora. Los miembros comunes de SOB (como Beggiatoa spp. y/o Rhodobacterales) representan un componente muy pequeño de los consorcios microbianos BBD que se obtuvieron de ubicaciones geográficas muy diferentes17,19,20,24,25,26,27,28. Esto sugiere que la actividad de SOB en sí misma no es el principal impulsor de la patogénesis de BBD, pero que su escasez puede ayudar en la acumulación de sulfuro dentro de las lesiones de BBD15. No obstante, otra investigación del Mar Rojo informó que Arcobacter sp. (es decir, los otros miembros SOB viables) fue muy abundante en las lesiones BBD28. Además, los BBD también han mostrado una baja diversidad bacteriana y un patrón de composición bacteriana similar en el verano, cuando son muy activos, en comparación con el BBD inactivo en invierno y la etapa menguante de BBD en otoño29. Un precursor de BBD, conocido como estado de parche de cianobacterias (CP), también mostró una baja tasa de migración y una alta diversidad bacteriana en comparación con el estado normal de BBD20. Debido tanto a la complejidad como al dinamismo del consorcio microbiano BBD, la etiología y los mecanismos subyacentes de patogenia y virulencia de BBD siguen sin resolverse15, especialmente cuando se trata de su conexión con la composición y localización bacteriana. Además, las localizaciones microbianas a escala fina dentro de las lesiones de BBD no se han explicado por completo, y hacerlo podría dilucidar la dinámica polimicrobiana de BBD15.

Para caracterizar el consorcio microbiano involucrado en la virulencia de BBD, examinamos cómo la composición y la localidad de las comunidades bacterianas diferían con la tasa de migración de BBD (un indicador de virulencia). Este estudio examinó específicamente cómo los consorcios polimicrobianos dentro de las lesiones BBD difieren en las tasas de migración mediante el uso de un microscopio electrónico de barrido (SEM), la secuenciación de la comunidad bacteriana y un método combinado de hibridación fluorescente in situ (FISH) y corte de coral no descalcificado. Para tener en cuenta las variaciones regionales, se recolectaron muestras de BBD de dos ubicaciones geográficas en Okinawa, Japón (Fig. 1 complementaria).

En la isla Sesoko y la isla Aka, Okinawa (Fig. 1 complementaria), 38 lesiones BBD (una lesión por colonia; n = 9 cada una en 2014 y n = 10 cada una en 2015) de diferentes profundidades mostraron tasas de migración lineal que van desde 0,30 a 6,36 mm/día (Fig. 2a complementaria). No se encontró correlación entre la tasa de migración y la profundidad (correlación de rango de Spearman, ⍴ = 0,21, valor de p = 0,21). Además, aunque la temperatura del agua fluctuó entre las ubicaciones y los años (Fig. 2b complementaria), no hubo diferencias en las tasas de migración perfiladas para cada ubicación y año (ANOVA de una vía, F = 0,95, valor de p = 0,43). Las dieciocho lesiones de BBD de 2014 y una selección aleatoria de doce de las 20 lesiones de BBD de 2015 se utilizaron en el análisis posterior de la observación SEM y una combinación de perfil bacteriano 16 S y FISH, respectivamente.

Las imágenes SEM de la superficie de la estera BBD adyacente al tejido de coral sano mostraron morfológicamente la presencia de numerosos microbios que comprenden cianobacterias filamentosas más delgadas (Fig. 3a complementaria), cianobacterias filamentosas relativamente más gruesas (Fig. 3b complementaria), microorganismos filamentosos (Fig. 3c complementaria), otras bacterias en forma de bastón (Fig. 3d complementaria) y dos tipos de ciliados (Fig. 3e-f complementaria). Se observaron estructuras de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) en la superficie de la agregación de cianobacterias en las muestras de la isla Aka, mientras que las estructuras de EPS generalmente no se observaron en cada uno de los filamentos de cianobacterias individuales de la isla Sesoko (Fig. 2). Independientemente de la presencia o ausencia de las matrices de EPS, los microorganismos encontrados en los tapetes BBD de ambos lugares fueron morfológicamente similares. En el área BBD, dentro de 1 mm del borde del tejido de coral sano, las cianobacterias filamentosas más delgadas (Fig. 3a complementaria) dominaron la alfombra de manera consistente en todas las muestras, independientemente de la ubicación y la tasa de migración (Fig. 2). Las cianobacterias filamentosas más gruesas (Fig. 3b complementaria) se encontraron solo en las muestras con tasas de migración de 2,74 mm/día desde la isla Aka y 4,18 mm/día desde la isla Sesoko. Los microorganismos filamentosos (Fig. 3c complementaria) aparecieron en las muestras de ambos lugares con tasas de migración de 1,89 mm/día a 3,99 mm/día. Los ciliados mostraban dos formas diferentes: un cuerpo alargado en forma de tubo (Tipo A, Fig. 3e complementaria) y un cuerpo en forma de gránulo (Tipo B, Fig. 3f complementaria). Los ciliados tipo A y B se observaron ampliamente en la superficie de las muestras con varias tasas de migración que oscilaron entre 0,30 y 5,63 mm/día y entre 1,53 y 5,96 mm/día, respectivamente.

La muestra de la isla Sesoko (a, partes superiores en el panel b) muestra filamentos de cianobacterias sin impurezas en las superficies que la isla Aka. En la isla Aka, las muestras (partes inferiores en el panel byc) mostraron sustancias poliméricas extracelulares (EPS) en las superficies. Comparación de las apariencias de la superficie entre dos ubicaciones a través de varias tasas de migración (b). Las barras de escala indican 200 µm (a y c) y 20 µm (b). La dirección de la migración de BBD es de derecha a izquierda (a y c).

Doce bandas BBD separadas (una banda por colonia individual) con diferentes tasas de migración lineal, que van desde 2,13 a 6,36 mm/día (Fig. 3a), contenían una variedad de comunidades bacterianas (Fig. 3b). La diversidad alfa de las bacterias (revelada por los índices de riqueza de OTU y Chao1 observados) se correlacionó negativamente con las tasas de migración (correlación de rango de Spearman, ⍴ = −0,80, valor de p < 0,01 y ⍴ = −0,74, valor de p < 0,01) (Fig. 3c). Como advertencia, una muestra de datos de composición (SF_04) que muestra una baja migración de BBD (2,34 mm/día) y una gran diversidad se identificó como un valor atípico potencial (puntuación z = 3,04). Sin el valor atípico, el resultado aún mostraba una correlación significativamente negativa con la tasa de migración (correlación de rango de Spearman, ⍴ = −0,76, valor de p < 0,01 para las OTU observadas y ⍴ = −0,68, valor de p < 0,05 para los índices de riqueza de Chao1). Para evitar sesgos debido a los datos de composición en la correlación con la migración, aplicamos una transformación de relación logarítmica (clr) centrada en nuestros datos para los análisis posteriores y la visualizamos en el análisis de componentes principales basado en la transformación (tb-PCA; Fig. 3d ). La ubicación y la profundidad del muestreo no tuvieron un efecto significativo sobre las diferencias en las comunidades bacterianas transformadas por clr a nivel de familia (PERMANOVA, ubicación: R2 = 0,12, valor de p = 0,21; profundidad: R2 = 0,06, valor de p = 0,76; y ambos ubicación y profundidad: R2 = 0,07, valor de p = 0,75). Para evaluar la correlación entre las matrices de distancia basadas en la tasa de migración y la abundancia de la comunidad bacteriana transformada por clr, se realizó una prueba de Mantel y no mostró una correlación significativa (R: 0,06786, valor p: 0,297). Sin embargo, el patrón de correlación parcial entre bacterias representativas a nivel de familia con tasas de migración fue verificado por la matriz de transformación clr. Solo dos familias SOB potenciales, Rhodobacteraceae y Arcobacteraceae, se correlacionaron significativamente negativa y positivamente con las tasas de migración lineal (correlación de rango de Spearman, ⍴ = –0,59, valor de p < 0,05, ⍴ = 0,85 y valor de p < 0,01), respectivamente (Fig. .4 y Tabla Suplementaria 3). 44 OTU (unidades taxonómicas operativas) en todas las muestras pertenecían a la familia Rhodobacteraceae (Tabla complementaria 1), y solo dos OTU (OTU 6 y OTU24), que van desde 0.01 a 13.47% y desde 0.01 a 6.96%, respectivamente, tenía> 1% de la abundancia relativa total en la escala de suma total (Tabla complementaria 2). OTU 6 se asignó al género Ruegeria y coincidió exactamente con la secuencia de una proteobacteria alfa 128-64 no cultivada (AF473938) que se recuperó de BBD en el Mar Caribe (Tabla complementaria 2). OTU 24 se identificó como el género Thalassobius y era 100 % similar tanto a un clon de bacteria sin cultivar BBD-Aug08-3BB-36 (GU472129) como a un clon de bacteria sin cultivar Otu0020 (MH341656) en un tapete BBD del Mar Rojo (Tabla complementaria 2 ). Como oxidantes de sulfuro viables o bacterias heterótrofas (ver más detalles en la discusión), se encontraron Arcobacteraceae con 14 OTU en todas las muestras de BBD en las diversas tasas de migración, tres de las cuales fueron OTU 8, OTU 9 y OTU11, que oscilaron entre 0.54 - 10,84 % en seis muestras, 0,03 - 10,81 % en nueve muestras y 0,01 - 5,46 % en todas las muestras, respectivamente, en escala de suma total (Tabla complementaria 2). Las tres OTU en Arcobacteraceae estaban estrechamente relacionadas con las bacterias (con una similitud del 98,88 al 100 %) que se observaron en BBD en el Océano Indo-Pacífico y el Mar Caribe (Tabla complementaria 2). Seis de las 14 OTU (incluida la OTU representativa 9) en Arcobacteraceae se correlacionaron positivamente con las tasas de migración (Fig. 4a complementaria). En una ubicación filogenética de lecturas cortas de OTU, las 14 OTU estaban distantes entre sí en la familia Arcobacteraceae en el árbol de referencia, aunque algunas OTU estaban agrupadas. Por ejemplo, OTU 8 y OTU 1074 agrupados en un grupo (Figura complementaria 4b). Tres OTU (OTU 27, OTU 192 y OTU 952) pertenecían al género Malarcobacter, una OTU (OTU 144) pertenecía al género Halarcobacter y otras OTU se clasificaron en un grupo no cultivado (Figura complementaria 4b). Aunque otras familias (ver más detalles en la Tabla complementaria 3 y la Nota complementaria 1) no mostraron una correlación significativa, como las cianobacterias pertenecientes a Desertifilaceae, tendieron a aumentar positivamente junto con las tasas de migración (Tabla complementaria 3).

A lo largo de varias tasas de migración de BBD desde dos ubicaciones (a), gráficos de burbujas que muestran la abundancia bacteriana relativa (representada por tamaño) de las 24 familias principales, bacterias no clasificadas y otras (que se agruparon en promedio <0.5% de esa abundancia relativa) en total suma de escala (b). Correlaciones significativas entre las tasas de migración y las diversidades alfa (riqueza OTU e índice Chao1) de BBD calculadas por la correlación de rango de Spearman en la escala de suma total (c). El sombreado gris muestra intervalos de confianza del 95 % para la correlación de rango de Spearman (c). Un análisis de componentes principales basado en la transformación clr (tb-PCA) que representa las comunidades bacterianas (nivel familiar) en BBD (d). Los ID de muestra indicados como 'AF' y 'SF' se recolectaron de la isla Aka y la isla Sesoko, respectivamente.

La matriz transformada por clr para cada familia (a: Rhodobacteraceae yb: Arcobacteraceae) se sumó en las OTU. Correlación significativa marcada como * p < 0,05 y ** p < 0,01. El área gris sombreada representa el intervalo de confianza del 95%.

Para estudiar la localización bacteriana en BBD a través de tasas de migración distintivas, aplicamos FISH para inspeccionar la distribución bacteriana en las mismas muestras de BBD que se usaron en el análisis de la comunidad bacteriana. Dado que las secuencias afiliadas a la familia Arcobacteraceae mostraron aumentos significativos con la tasa de migración (Fig. 4b), usamos la sonda Arc9430, junto con la sonda bacteriana de amplio rango EUB338mix31, para apuntar a Arcobacteraceae. Antes de realizar el FISH, evaluamos la sonda recientemente diseñada que podría cubrir las 14 OTU en Arcobacteraceae mediante un análisis in-silico. Diez de las 14 OTU, incluidas dos OTU representativas (OTU 8 y OTU 9), se combinaron idealmente con la sonda específica Arc94 según el análisis de ubicación filogenética (Figura complementaria 4b).

Para visualizar la distribución bacteriana intacta y su ubicación en los corales, incluido su tejido y esqueleto, utilizamos un método establecido recientemente en el que FISH32 se combinó con cortes de coral no descalcificados33. Aunque se detectaron señales de unión no específicas de la sonda FISH en la región del esqueleto de coral (Fig. 5 complementaria), visualizamos con éxito la localidad bacteriana dentro del tejido de coral y las estructuras del esqueleto intactas (Fig. 6 complementaria).

Muchas señales de la sonda EUB338mix indicaron la localización bacteriana en la capa microbiana desde el límite del tejido coralino sano hasta la banda negra. Mientras tanto, las señales de la sonda EUB338mix estaban ausentes o eran pocas dentro del tejido sano. La localización bacteriana mostró una estructura estratificada verticalmente en la capa dominada por cianobacterias donde las cianobacterias cubrían la capa superior, mientras que muchas bacterias se propagaban alrededor de los tejidos de coral necróticos y los dinoflagelados simbióticos debajo de la capa de cianobacterias (Fig. 5a). En secciones seriadas, también se observaron ensamblajes y células individuales de Arcobacteraceae debajo de la capa de cianobacterias utilizando la sonda específica Arc94 (Fig. 5b). Mientras que los ensamblajes bacterianos de las señales EUB338mix mostraron una variedad de formas individuales (Fig. 5c), los ensamblajes de Arcobacteraceae mostraron casi la misma morfología celular (bacterias en forma de bastón, Fig. 5d). Además, el patrón de distribución de Arcobacteraceae indicó sus estrechas asociaciones con tejidos necróticos de coral (Fig. 5d).

Micrografías de fusión confocal de la estructura de la estera microbiana de BBD que muestran autofluorescencia (el azul indica tejido de coral y el verde indica clorofila de dinoflagelados simbióticos [Sym] y cianobacterias) y las bacterias hibridadas con la sonda etiquetando Cy3 (rojo) (anuncio). Las cianobacterias se muestran en un color amarillo que fusionó dos canales de autofluorescencia de clorofila y señales bacterianas con Cy3 (a y c). Las líneas punteadas en ayb delinean regiones de primer plano ampliadas (c y d). Las señales hibridadas de Arcobacteraceae muestran sus ensamblajes y células dispersas (línea de puntos y puntas de flechas amarillas en b). Las barras de escala representan 30 µm.

Para examinar la relación entre la localidad bacteriana y la tasa de migración, las áreas de presencia bacteriana de todas las bacterias y Arcobacteraceae se cuantificaron espacialmente en las capas superior, media e inferior de los tapetes microbianos (cada intervalo vertical de 1 mm, Fig. 6a) y en comparación con las tasas de migración. Dadas las observaciones SEM y el análisis de la comunidad bacteriana que muestran que las cianobacterias dominantes siempre ocurrieron en la capa superior, el área de cianobacterias filamentosas se excluyó en este análisis cuantitativo (en lo sucesivo, el "área de todas las bacterias" se define como la que tiene una distribución de bacterias, excluyendo cianobacterias). FISH se realizó utilizando las sondas EUB338mix y Arc94 en secciones en serie para que las distribuciones de bacterias objetivo pudieran compararse de manera óptima (Fig. 6b, c). El área de detección de todas las bacterias, que se midió con la sonda EUB338mix, fue mayor que el área de Arcobacteraceae, que se midió con una sonda Arc94 específica (Fig. 6d). Ambas señales FISH se detectaron en las tres capas a través de diferentes tasas de migración (Fig. 6e-j). En la capa superficial, la detección de todas las bacterias y Arcobacteraceae no mostró ninguna relación con la tasa de migración (Fig. 6e, f). Solo en la capa media aumentó el área de Arcobacteraceae con la tasa de migración (adj. R-squared 0.04 y valor de p <0.05) (Fig. 6g, h). Por el contrario, el área de todas las bacterias mostró una relación significativamente positiva con la tasa de migración, pero solo en la capa inferior (adj. R-squared 0.06 y valor de p <0.05) (Fig. 6I, g).

Ilustración esquemática que muestra tres capas (superficie, medio e inferior; cada intervalo vertical es de 1 mm) en tapetes BBD para el análisis espacial (a). Micrografías de combinación confocal que muestran la localización bacteriana espacial (rojo) de todas las bacterias (b) y Arcobacteraceae (c) en dos secciones en serie; hibridado con sondas EUB338mix y Arc94, respectivamente. Las barras de escala indican 50 µm (b y c). Diagramas de puntos combinados con diagramas de caja que muestran el área completa de todas las bacterias (excepto las cianobacterias filamentosas) y las detecciones de Arcobacteraceae en las diversas tasas de migración (representadas por color; los ID de muestra 'AF' y 'SF' indican la recolección de la isla Aka y la isla Sesoko , respectivamente) (d). Las líneas centrales del diagrama de caja representan los valores medianos, los límites de la caja son el 25 y el 75 % de la muestra, y los cuartiles superior e inferior representados en barras son el 5 y el 95 % de la muestra (d). Regresiones lineales que muestran las asociaciones entre la migración y las áreas de presencia bacteriana (todas las bacterias [e, g, i] y Arcobacteraceae [f, h, y j]) en la superficie (e y f), medio (g y h), y capas inferiores (I y j). La correlación significativa se muestra en rojo, con un valor de p < 0,05.

En este estudio, demostramos con éxito que la migración (es decir, un indicador de la virulencia) de la estera microbiana dominada por cianobacterias está vinculada tanto a la composición bacteriana como a la localización espacial utilizando una combinación novedosa de perfiles bacterianos 16 S, cortes no descalcificados y FISH. La comunidad bacteriana BBD en este estudio, que mostró un patrón de migración único como una biopelícula en forma de banda, estaba compuesta por grupos que se volvieron menos diversos a medida que aumentaba la tasa de migración. En el análisis de la comunidad bacteriana, también encontramos que las abundancias relativas de las familias Rhodobacteraceae y Arcobacteraceae tenían correlaciones negativas y positivas con las tasas de migración de BBD, respectivamente. Además, a medida que aumentó la tasa de migración de BBD, la población de Arcobacteraceae aumentó significativamente en la capa intermedia, mientras que todas las poblaciones de no cianobacterias aumentaron en la capa inferior.

Arcobacteraceae se propuso recientemente como una nueva familia (en el orden Campylobacterales, la clase Campylobacteria y el phylum Campylobacterota) del género Arcobacter en Phylum Epsilonproteobacteria34. Posteriormente, se propusieron seis géneros nombrados y se sacaron del género original Arcobacter en Arcobacteraceae35. Sin embargo, recientemente una nueva propuesta realizada por On et al. ha reclasificado los géneros de la familia Arcobacteraceae en el único género Arcobacter nuevamente36. Nuestros resultados sugieren que Arcobacteraceae (= Arcobacter sensu lato34,35,36) está profundamente implicada en la patogenicidad de BBD. La presencia de Arcobacter en BBD se ha informado comúnmente en una amplia gama de regiones geográficas en el Caribe, el Indo-Pacífico y el Mar Rojo28,29,37,38. Las arcobacteraceae son, en general, aerotolerantes, psicrotróficas36 y ubicuas en ambientes y animales39. Teniendo en cuenta la condición óxica espacialmente (especialmente verticalmente) y temporalmente heterogénea dentro de BBD mat40, nuestro hallazgo de que las poblaciones de Arcobacteraceae aparecieron en todas las capas de BBD con tasas de migración bajas a altas sugiere que las Arcobacteraceae asociadas con BBD son aerotolerantes.

Un miembro de Arcobacteraceae aislado de ambientes marinos ha sido identificado como un oxidante de sulfuro autótrofo o quimiolitoheterótrofo a través de análisis in vitro e in silico41,42,43. En un estudio anterior de BBD, la abundancia relativa de Rhodobacteraceae disminuyó durante la transición del desarrollo de BBD desde el precursor de BBD, llamado "parche de cianobacterias" (CP), que progresó a un ritmo más lento, mientras que la abundancia relativa de Arcobacter spp. aumentó a medida que BBD se desarrolló con mayor virulencia20. La contribución de Rhodobacterales en BBD se ha confirmado mediante el perfilado utilizando un gen funcional clave (soxB) para la oxidación de sulfuros en BBD. Sin embargo, la abundancia relativa de genes soxB afiliados a Rhodobacterales aumentó más en la estera BBD en comparación con CP17. Los genes soxB derivados de Arcobacter no se detectaron, presumiblemente porque los cebadores universales para los genes soxB son incapaces de identificar secuencias del género Arcobacter44. De hecho, un estudio de secuenciación de metagenoma de escopeta, libre de sesgos de PCR, informó que Arcobacter es un miembro importante de SOB en BBD38. En conjunto, existe una gran posibilidad de que Arcobacter desempeñe un papel en la etapa de oxidación del sulfuro del ciclo del azufre en el consorcio BBD. Además, dado que Arcobacter oxidante de azufre es altamente resistente a niveles altos de sulfuro de hidrógeno y bajos de oxígeno y, por lo tanto, compite de manera efectiva con otros SOB concurrentes45, nuestros resultados indican que un nicho funcional de la oxidación de sulfuro en el BBD puede haberse transferido de Rhodobacteraceae a Arcobacteraceae a medida que la virulencia de BBD se hizo mayor.

Nuestros resultados de FISH mostraron que la población de Arcobacteraceae, particularmente en la capa media de la estera BBD, se correlacionó leve pero positivamente con las tasas de migración. Aunque las distribuciones químicas verticales de sulfuro de hidrógeno y oxígeno varían dinámicamente en el tapete BBD desde el día (el sulfuro de hidrógeno bajo y el oxígeno disminuyen verticalmente con la profundidad del tapete) hasta la noche (el sulfuro de hidrógeno aumenta verticalmente y el tapete se vuelve completamente anóxico)40, Arcobacter podría ser capaz de mediar dentro de cualquier condición y mantener su abundancia46. Además, se ha informado que un miembro de Arcobacter (Candidatus A. sulfidicus) es un microaerófilo altamente móvil, que parece ser típico de los organismos que viven en interfaces óxico-anóxicas45. Teniendo en cuenta la condición química en BBD durante el día40 en que recolectamos muestras, la capa intermedia de la estera de BBD podría permitir que Arcobacteraceae prolifere y se adapte a las condiciones ambientales, incluidos los niveles de sulfuro de hidrógeno y oxígeno, y simultáneamente proporcione el sulfato para SRB por el sulfuro. oxidación y desempeñar un papel en la promoción o el cambio de la migración del consorcio que podría asociarse con la virulencia BBD. Además, dado que el género Arcobacter también tiene el conjunto completo de genes responsables de la reducción de sulfato asimilatoria de acuerdo con la predicción del genoma completo46, se requieren estudios futuros para confirmar el papel de Arcobacteraceae no solo en la oxidación de sulfuro sino también en la reducción de sulfato en la estera BBD.

Arcobacteraceae en BBD también podría comportarse como patógenos que dañan directamente los tejidos de coral. Arcobacter también se ha detectado abundantemente en lesiones enfermas de muchas enfermedades coralinas distintas de BBD, como White Pox47, White Syndrome48, Brown Band Disease48 y Stony Coral Tissue Loss Disease49 en los arrecifes de coral del mundo. Ensayos de cultivo de células animales y humanas in vitro han demostrado que Arcobacter tiene una virulencia significativa cuando se trata de la formación de colonias y el establecimiento de la infección en los tejidos del huésped50,51, y también se sabe que la mayoría de Arcobacter están equipados con genes de virulencia como ciaB, irgA , y cadF52,53. Por lo tanto, la presencia de Arcobacter patogénico en organismos marinos justifica una investigación más enfocada.

Los biofilms han estado involucrados en muchas infecciones clínicas, y la evidencia acumulada muestra que los biofilms contribuyen a la patogénesis, especialmente a la infección crónica54 y la placa oral55. De las biopelículas patogénicas, los sistemas mejor estudiados incluyen la placa oral humana. Después de una limpieza parcial de la biopelícula polimicrobiana por eliminación física, el ciclo de colonización se repite en la misma transición sucesional espaciotemporal general hasta que se repuebla una comunidad madura de microbios56. Durante la transición, la colonización bacteriana temprana y la composición varían entre los individuos, pero los géneros más abundantes suelen conservarse. A menudo se cree que los cambios bruscos o sutiles en la composición bacteriana promueven fenotipos asociados a enfermedades57. Las asociaciones polimicrobianas específicas en la periodontitis humana pueden exacerbar la gravedad y progresión de la enfermedad57. En BBD, se demostró que la diversidad de bacterias alfa estaba negativamente correlacionada con la migración. Estudios previos han encontrado que BBD y CP (parche de cianobacterias) no activos están asociados con una alta diversidad bacteriana y tasas de migración baja y no migratoria, respectivamente20,29. El resultado de FISH mostró un ligero aumento en la población bacteriana junto con una tasa de migración creciente y podría sugerir que el consorcio bacteriano BBD podría elaborarse con una baja diversidad proliferando en esteras BBD individuales. Sin embargo, la variación de las tasas de migración de BBD no pudo vincularse con las comunidades bacterianas específicas que aparecieron en BBD con una alta tasa de migración. De hecho, la familia bacteriana Vibrionaceae, que incluye algunas especies que se sabe que son patógenos de coral58,59, apareció independientemente del gradiente de migración (Fig. 2b). Sin embargo, ciertamente se confirmó una tendencia de disminución de Rhodobacteraceae y aumento de Arcobacteraceae entre BBD con una alta tasa de migración.

En el experimento FISH, las bacterias en el tapete microbiano BBD mostraron patrones de distribución espacial con varias tasas de migración. Además de la población de Arcobacteraceae, todas las poblaciones bacterianas en la capa inferior mostraron una correlación positiva débil con la tasa de migración de BBD. En combinación con los resultados de la comunidad bacteriana, nuestra visualización microbiana sugirió que la estructura de la comunidad bacteriana vinculada a la alta virulencia de BBD prospera bajo una fuerte selección que excluye a otras bacterias, especialmente en la capa inferior. En la capa inferior de BBD, donde se prevén condiciones anóxicas o de bajo nivel de oxígeno, incluso durante el día15, es posible que se proporcione un nicho tanto para SRB como para heterótrofos anaeróbicos.

Este estudio demuestra por primera vez la correlación entre los cambios en la composición bacteriana/localización espacial y la tasa de migración de BBD, específicamente BBD en el coral Montipora. En resumen, este estudio proporciona nuevos conocimientos sobre la dinámica microbiana de BBD e indica que el modelo de patogénesis mediado por microbios en BBD es más complicado de lo que se pensaba anteriormente. Sin embargo, nuestros resultados indican que Arcobacteraceae podría ser una de las bases clave en la estructura de la comunidad bacteriana de BBD virulenta. Dada la correlación positiva entre Arcobacteraceae y la virulencia de BBD, proponemos que Arcobacteraceae sea un biomarcador potencial para la virulencia de BBD. Estos hallazgos deben probarse en otros taxones de coral diversos, ya que se sabe que muchas especies se ven afectadas por BBD. Además, fomentamos una mayor investigación sobre otras enfermedades de los corales utilizando nuestra combinación recientemente desarrollada de comunidad bacteriana y FISH con técnicas de corte sin descalcificar para revelar la composición bacteriana/localización espacial intacta junto con la virulencia de las enfermedades de los corales.

Este estudio se realizó en dos arrecifes cerca de la isla Sesoko (26°38′35.2″N, 127°51′49.5″E) y la isla Aka (26°12′00.0″N, 127°16′45.0″E) en Okinawa, Japón (Fig. 1 complementaria). Los sitios están ubicados a aproximadamente 70 km de distancia entre sí y tienen mar abierto entre ellos. Se midieron las tasas de migración lineal en un total de 38 colonias de Montipora incrustantes infectadas con BBD en el verano de 2014 (n = 9 en cada ubicación) y 2015 (n = 10 en cada ubicación). Para determinar la tasa de migración lineal de BBD en cada colonia individual, se tomaron fotografías del frente de la lesión de BBD en una región plana de la colonia, tanto tres días antes del muestreo como el mismo día del muestreo. Las tasas promedio de migración lineal (mm/día) de BBD como variable en los modelos a continuación se calcularon en cinco puntos aleatorios en la región de cada colonia utilizando el software Fiji60. También medimos las profundidades de cada colonia infectada con BBD y registramos la temperatura del agua (con intervalos de una hora) usando un Onset HOBO Pendant logger® durante la observación. Para evaluar la correlación entre la tasa de migración y la profundidad, se realizó la correlación de rango de Spearman utilizando el software estadístico R v4.0.261. La comparación de la varianza de las tasas de migración entre ubicaciones y años también se verificó mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA unidireccional) utilizando el software estadístico R v4.0.261.

Para los análisis posteriores, las muestras de las 18 colonias en 2014 y 12 de las 20 colonias en 2015 (n = 6 de cada ubicación) se obtuvieron para la observación con microscopio electrónico de barrido (SEM) y el análisis combinado de la comunidad bacteriana y FISH, respectivamente. Cada muestra (una muestra por colonia individual) de la región BBD que contenía tejido sano y esqueleto (aproximadamente 3–4 cm de largo y ancho y un cm de profundidad) se cortó con un martillo y un cincel en el área donde se produjo la migración lineal. se midieron las tasas. Para SEM, las muestras se recortaron en un cuadrado de aproximadamente 1 cm, se fijaron inmediatamente con glutaraldehído (GA) al 2 % en solución salina tamponada con fosfato 10 mM (PBS, pH 7,4) en hielo y se almacenaron secuencialmente a 4 °C. Para el análisis de la comunidad bacteriana y el análisis de combinación FISH, las muestras se cortaron en dos piezas cada una de aproximadamente 2 cm cuadrados. Se extrajo una muestra de la banda negra con un punzón de cuero esterilizado (diámetro circular de 4 mm) y la banda se almacenó en 300 µl de etanol al 100 % a -80 °C para el análisis de la comunidad bacteriana. El segundo espécimen (un cuadrado de aproximadamente 2 cm) se fijó inmediatamente en paraformaldehído (PFA) al 4 % en PBS (Wako, Japón) a 4 °C durante 8 h, se enjuagó tres veces con etanol al 70 % y se almacenó en etanol al 70 %. 4 °C para PESCADO a continuación.

Las muestras fijadas con GA (n = 18) se enjuagaron suavemente en PBS durante 15 min tres veces y se deshidrataron en una serie de gradientes de etanol/agua (20, 40, 60, 70, 90 y 100 % una vez, y etanol absoluto). tres veces) durante 20 min cada una a temperatura ambiente. Las muestras fijadas con GA deshidratadas se sumergieron en agua abs. serie graduada de etanol/alcohol t-butílico (7:3 y 1:1 durante 15 min cada una), transferida a alcohol t-butílico a más de 25,5 °C durante 60 min y colocada en un refrigerador después de cambiar el alcohol t-butílico viejo con alcohol nuevo. Las muestras se secaron utilizando un dispositivo de secado por congelación (VFD-21S, SHINKKU VD, Japón) durante 3 horas y se recubrieron con una aleación de platino/paladio en pulverización iónica (E-1010, HITACHI, Japón). La observación y la adquisición de imágenes se realizaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEMS-3500N, HITACHI, Japón). Observamos los microorganismos en el área de la superficie dentro de 1 mm desde el borde con tejido de coral sano hasta las esteras BBD, y determinamos la presencia o ausencia de microorganismos mediante fotografías aleatorias. Se tomaron un total de 42 imágenes (6 imágenes con un aumento de 100x, 18 imágenes con un aumento de 1000x y 18 imágenes con un aumento de 2000x) de cada lesión BBD.

A las muestras perforadas con BBD (n = 12) en 300 µl de etanol al 100 %, se les añadieron directamente 120 µl de agua libre de nucleótidos y 12 µl de acetato de sodio 3 M, se mezclaron mediante agitación vorticial y se almacenaron a -20 °C durante 45 mín. Después de una centrifugación a 18.000 × g durante 20 min, el sedimento se resuspendió en 300 µl de etanol al 70 % preenfriado, se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones anteriores, se retiró de la solución y se secó. El ADN genómico se extrajo del sedimento con el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), que incluyó la adición de un paso de lisis enzimática basado en lisozima (tampón: 20 mg/ml de lisozima, Tris-HCl 20 mM [pH 8,0], 2 mM EDTA [pH 8,0] y Triton X-100 al 1,2 %) según el protocolo del fabricante.

El ADN genómico se utilizó como plantilla para la amplificación de la región V4 del gen 16 S rRNA bacteriano utilizando el conjunto de cebadores universales (515 F y 806 R, Tabla complementaria 4) y el siguiente procedimiento de PCR: 35 ciclos de 30 segundos a 95 ° C (desnaturalización), 30 segundos a 51 °C (recocido), 30 segundos a 72 °C (extensión), seguido de una extensión adicional de 5 minutos a 72 °C. Luego, las secuencias de índice se agregaron mediante PCR utilizando el kit de índice Nextera XT (Illumina, EE. UU.). Los amplicones se enviaron para la secuenciación con una química de lectura de extremos emparejados mediante un secuenciador MiSeq (Illumina, EE. UU.). Las lecturas de secuenciación se resumen en la Tabla complementaria 5.

Las lecturas de extremos emparejados de cada muestra se fusionaron en el software QiimeI usando MacQIIME v.1.9162. Las secuencias combinadas obtenidas se filtraron en el software MOTHUR v.1.39.563 usando los siguientes criterios: (1) longitudes de lectura entre 249 y 256 pb; (2) puntaje de calidad de lectura promedio 27; y (3) longitud de lectura del homopolímero < 8 pb. Además, detectamos secuencias quiméricas utilizando el algoritmo USEARCH v.11.0.66764 y, posteriormente, excluimos las secuencias quiméricas. Implementamos USEARCH con un límite de similitud del 97 % para las OTU del clúster. Las OTU se asignaron a grupos taxonómicos conocidos mediante el mapeo en la base de datos Silva SSU r138.165 utilizando MOTHUR con un valor de corte de 80. Después de eliminar las secuencias de Eukaryota, Archaea, unknown y chloroplast, se asignaron un total de 1593 OTU bacterianas. a 255 familias (1401 OTU), bacterias no clasificadas (151 OTU), bacterias no cultivadas (31 OTU en 10 órdenes), familias no cultivadas (cuatro OTU en tres clases) y familias desconocidas (seis OTU en dos órdenes).

Los análisis estadísticos para el conjunto de datos de la comunidad bacteriana se realizaron con el software estadístico R v4.0.261, que incorpora el paquete R phyloseq v.1.34.066 y vegan v. 2.5–767. Los índices de diversidad alfa (riqueza de OTU y Chao1) se calcularon utilizando la función "estimate_richness" dentro de phyloseq, y la correlación a lo largo de las tasas de migración se utilizó la correlación de rango de Spearman en el software de estadísticas R v4.0.261. Para el análisis de diversidad beta, los datos de phyloseq a nivel de familia se transformaron usando la función de transformación Centered Log Ratio (clr) en un microbioma del paquete R v. 1.12.068, y se calculó una matriz de distancia usando la distancia euclidiana con la función "distancia" de el paquete R phyloseq. El análisis de componentes principales basado en la transformación (tb-PCA) se visualizó con la función "ordinate" del paquete R phyloseq. Para evaluar el impacto de las diferencias en la ubicación y la profundidad de muestreo en los datos de composición, se realizó una prueba de análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA) utilizando la función "adonis2" del paquete R vegan. Para evaluar la correlación entre la diferencia en las tasas de migración y la diferencia en la composición de la comunidad bacteriana, la tasa de migración se convirtió a una matriz de distancia con distancia euclidiana usando la función "dist" en el software estadístico R, y se aplicó una prueba de Mantel. a la matriz de distancia transformada por clr de la estructura bacteriana y las matrices de distancia de migración en el paquete R vegano (correlación de rango de Spearman y 999 permutaciones). Posteriormente, se determinó un análisis de correlación parcial usando la matriz de transformación clr de cada familia bacteriana representativa y la tasa de migración lineal BBD calculada usando la prueba de correlación de rangos de Spearman en el software estadístico R.

Además, las OTU representativas (que mostraban > 1 % en la escala de la suma total) se sometieron a búsquedas BLAST de nucleótido-nucleótido para identificar a sus parientes más cercanos en la base de datos GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi). Las secuencias más cercanas se eligieron por su alta similitud y posición de linaje en blastn (recopilación de nucleótidos nr/nt) y la función "Blast Tree View (método de árbol: evolución mínima rápida y diferencias máximas de secuencia: 0,75)". Cuando los resultados alcanzan múltiples secuencias, seleccionamos aquellas de fuentes relacionadas con BBD, enfermedades de los corales y corales saludables.

De acuerdo con el análisis de correlación parcial, la familia Arcobacteraceae incluyó 14 OTU que se correlacionaron positivamente con la migración de BBD. Por lo tanto, realizamos FISH en 12 muestras utilizando las sondas específicas, EUB338mix31,69 para la mayoría de las bacterias y Arc9430 para Arcobacteraceae (Tabla complementaria 4), con un método de sección delgada sin descalcificar, después de estimar la especificidad de la sonda para las 14 OTU.

Para estimar la especificidad de la sonda para las 14 OTU de Arcobacteraceae, se recuperaron de la base de datos Silva SSU r138 653 secuencias de referencia asignadas a la familia Arcobacteraceae compuesta por los géneros Arcobacter, Malaciobacter, Halarcobacter, Pseudarcobacter, Poseidonibacter y Arcobacteraceae sin cultivar. También se probó la coincidencia de las secuencias de referencia con la sonda Arc9430 para Arcobacter usando TestProbe 3.0 (https://www.arb-silva.de/search/testprobe/), y la sonda estimó una cobertura de Arcobacteraceae en 78,0% (509 de de 653 secuencias de referencia). Para la construcción del árbol de referencia se alinearon las secuencias de referencia utilizando el software infernal v.1.1.370 y se construyó un árbol de máxima verosimilitud en RAxML-NG v.1.0.271 con modelo GTR+G y 200 replicas bootstrap. Luego, 14 secuencias OTU se alinearon con la alineación de secuencias múltiples de referencia usando el programa PaPaRa core v.2.572, posteriormente se colocaron con la puntuación de estimación más alta (like_weight_ratio) en el árbol de referencia por el software EPA-ng v.0.3.673, y luego el árbol se visualizó utilizando el árbol de la vida interactivo (iTOL) v.474 para la evaluación de la especificidad de la sonda. Las ubicaciones filogenéticas de la secuencia OTU fueron estimadas por EPA-ng en el árbol de referencia y definidas con un puntaje alto de "like_weight_ratio", cuando el algoritmo calcula múltiples lugares en el árbol de referencia (el puntaje definido en el rango de 0.15 a 0.99) .

Las muestras fijadas con PFA en etanol al 70 % se colocaron en PBS que contenía sacarosa al 10 % durante 1 hora a 4 °C y se transfirieron a sacarosa al 20 % durante la noche a 4 °C. Las muestras fijadas con PFA luego se incluyeron en el compuesto de inclusión (SCEM, SECTION LAB Co. Ltd, Japón) y se sumergieron en una mezcla de hielo seco y hexano hasta que se congelaron por completo. El corte sin descalcificar adherido a la película adhesiva33 se realizó para obtener tres secciones en serie de las muestras fijadas con PFA para especímenes de coral a 5 µm de espesor con una hoja de carburo de tungsteno (SL-T30, SECTION LAB Co. Ltd., Japón) usando un criostato (Leica CM1850, Alemania). Las secciones no descalcificadas unidas a la película adhesiva se sumergieron en etanol al 100 % durante 30 segundos para eliminar el compuesto y se secaron al aire. FISH se llevó a cabo como se describe en Wada et al.32 con ligeras modificaciones, incluido un paso sin desparafinado y un paso sin inmersión con solución de HCl. Es decir, las secciones secadas al aire se lavaron en una solución de Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) durante 10 min a temperatura ambiente, se montaron en una proteinasa K (50 µg/ml) con la solución de Tris-HCl 20 mM para 5 min a 37 °C, y enjuagado en la solución de Tris-HCl 20 mM antes de la hibridación. Cada sección en serie realizó una hibridación de sonda utilizando tres sondas que se marcaron con el fluorocromo Cy3: (1) EUB338mix31,69, (2) Non33875 en un tampón de hibridación (0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl y 0,01 % SDS) que contenía 30 % de formamida, y (3) Arc9430 a ese 20 % de formamida (Tabla complementaria 4) a 46 °C durante 1,5 h. Cada sección hibridada se lavó en tampones de lavado (Tris-HCl 20 mM, SDS al 0,01 %, EDTA 5 mM (pH 8,0) y NaCl (0,112 M para tratamientos con sonda EUB338mix y Non338 y 0,225 M para tratamiento con sonda Arc94)) a 48 ° C durante 10 min. Las secciones lavadas adheridas a la película adhesiva se lavaron con agua fría y se secaron al aire, se recolectaron en un portaobjetos de vidrio (S2441, MATSUNAMI) y luego se montó un cubreobjetos en el portaobjetos en una solución antidecoloración (Fluoromount/Plus, Diagnostic BioSystems) .

La adquisición de imágenes se realizó con un objetivo de aumento de 40x (HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2) en un microscopio confocal (TCS SP8, Leica). El fluorocromo Cy3 y la clorofila (para Symbiodiniaceae y cianobacterias) se excitaron a 552 nm (2,0 %) y se detectaron en un rango de emisión de 571–582 nm con HyD (modo estándar y ganancia 100) y de 650–696 nm con PMT (ganancia 700). ). La autofluorescencia de coral también se excitó a 405 nm (1,5 %) y se detectó en un rango de emisión de 460 a 510 nm con HyD (modo estándar y ganancia 161). Con el fin de analizar cuantitativamente el área de presencia de bacterias, se adquirieron seis imágenes (cada una con un tamaño de 1024 × 1024 píxeles) de cada una de las tres regiones de la sección transversal de BBD: capas superior, media e inferior (cada intervalo vertical de 1 mm , Figura 6a). Las señales de fluorescencia limitadas por cada sonda (EUB338mix y Arc94) se identificaron con señales específicas o uniones de sonda no específicas (utilizando la sonda Non338), según los criterios detallados por Wada et al.32.

El procesamiento de imágenes se realizó utilizando el software Fiji60 después de exportar las imágenes de fluorocromo y clorofila Cy3 a imágenes TIFF en escala de grises de 8 bits utilizando el software LAS X (Leica). Cada imagen en escala de grises se convirtió en una imagen binaria mediante una función de umbral utilizando el algoritmo "Entropía máxima"76. Para analizar la presencia de bacterias distintas a las cianobacterias en la señal Cy3 de la sonda EUB338mix, la región de cianobacterias en la señal de clorofila se sustrajo de la imagen binaria de la señal EUB338mix mediante la función "restar" y curación manual. La imagen binaria se filtró para reducir el ruido mediante la función "Eliminar valores atípicos" (Radio 1,5 y umbral 50). Además, dado que las señales del canal de fluorocromo Cy3 también contenían fluorescencia no específica de las regiones del esqueleto (Fig. 5 complementaria), la fluorescencia de las regiones del esqueleto se eliminó manualmente de la imagen binaria. Con base en las imágenes binarias, las áreas de bacterias totales, excepto las cianobacterias y Arcobacteraceae, se calcularon en píxeles (lo que refleja el tamaño de su población en términos de biomasa). La relación entre cada área de las tres capas y la tasa de migración lineal de BBD se midió utilizando un modelo de regresión lineal (una función "lm") en el software estadístico R v4.0.261.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos de secuenciación producidos en este estudio se enviaron al archivo de lectura DDBJ con el número de acceso DRA010783.

Stal, LJ, van Gemerden, H. & Krumbein, WE Estructura y desarrollo de una alfombra microbiana marina béntica. FEMS Microbiol. Ecol. 1, 111–125 (1985).

Artículo Google Académico

Stal, LJ Esteras de cianobacterias y estromatolitos. en Ecología de las cianobacterias II: su diversidad en el espacio y el tiempo (ed. Whitton, BA) 65–125, https://doi.org/10.1007/978-94-007-3855-3_4 (Springer Holanda, 2012).

Cissell, EC, Eckrich, CE & McCoy, SJ Esteras de cianobacterias como reservorios bénticos y vectores de patógenos de la enfermedad de la banda negra de coral. Ecol. aplicación 32, e2692 (2022).

Artículo PubMed Google Académico

Richardson, LL & Castenholz, RW Diel Movimientos verticales de la cianobacteria Oscillatoria terebriformis en una estera microbiana de aguas termales ricas en sulfuro. aplicación Reinar. Microbiol. 53, 2142–2150 (1987).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pitois, F., Jigorel, A. & Bertru, G. Dinámica de colonización de una capa de cianobacterias incrustantes en un río de aguas duras (Eaulne, Francia). geomicrobiol. J. 18, 139–155 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Antonius, A. Nuevas observaciones sobre la destrucción de coral en los arrecifes. en vol. 10 3 (Universidad de Puerto Rico (Mayagüez), 1973).

Rützler, K. & Santavy, DL La enfermedad de la banda negra de los corales de arrecife del Atlántico, I. Descripción del patógeno cianofito. Mar. Ecol. 4, 301–319 (1983).

Artículo Google Académico

Carlton, RG & Richardson, LL Dinámica de oxígeno y sulfuro en una estera de cianobacterias que migran horizontalmente: enfermedad de la banda negra de los corales. FEMS Microbiol. Ecol. 18, 155–162 (1995).

Artículo CAS Google Académico

Kuta, KG & Richardson, LL La enfermedad de la banda negra y el destino de las colonias de coral enfermas en los Cayos de Florida. proc. Arrecife de coral 8th int. sim. 1, 575–578 (1997).

Google Académico

Kuehl, K., Jones, R., Gibbs, D. & Richardson, L. Los roles de la temperatura y la luz en la progresión de la enfermedad de la banda negra (BBD) en los corales del género Diploria en las Bermudas. J. Invertebr. Patol. 106, 366–370 (2011).

Artículo PubMed Google Académico

Sato, Y., Bourne, DG & Willis, BL Efectos de la temperatura y la luz en la progresión de la enfermedad de banda negra en el coral de arrecife, Montiporahispida. Arrecifes de coral 30, 753 (2011).

Artículo Google Académico

Müller, EM et al. Un pH bajo reduce la virulencia de la enfermedad de la banda negra en Orbicella faveolata. PLoS One 12, e0178869 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Montano, S., Strona, G., Seveso, D., Maggioni, D. y Galli, P. Progresión lenta de la enfermedad de banda negra en Goniopora cf. las colonias de columna pueden promover su persistencia en una comunidad coralina. Mar. Biodivers. 45, 857–860 (2015).

Artículo Google Académico

Wada, N., Mano, N., Yanagisawa, Y. & Mori, T. Ocurrencia de enfermedades de coral en Akajima, Okinawa, Japón en 2010 y 2011. Galaxea, J. Coral Reef. Semental. 19, 35–44 (2017).

Artículo Google Académico

Sato, Y., Civiello, M., Bell, SC, Willis, BL & Bourne, DG Enfoque integrado para comprender el inicio y la patogenia de la enfermedad de la banda negra en los corales. Reinar. Microbiol. 18, 752–765 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Garrett, P. & Ducklow, H. Enfermedades de los corales en las Bermudas. Naturaleza 253, 349–350 (1975).

Artículo Google Académico

Bourne, DG, van der Zee, MJJ, Botté, ES & Sato, Y. Poblaciones bacterianas oxidantes de azufre dentro de lesiones de enfermedades coralinas dominadas por cianobacterias. Reinar. Microbiol. Rep. 5, 518–524 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bourne, DG, Muirhead, A. y Sato, Y. Cambios en las poblaciones de bacterias reductoras de sulfato durante el inicio de la enfermedad de la banda negra. ISME J. 5, 559–564 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sekar, R., Mills, DK, Remily, ER, Voss, JD y Richardson, LL Comunidades microbianas en la capa superficial de mucopolisacáridos y la capa microbiana de banda negra de Siderastrea siderea enferma de banda negra. aplicación Reinar. Microbiol. 72, 5963–5973 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sato, Y., Willis, BL & Bourne, DG El perfilado basado en pirosecuenciación de genes 16S rRNA de arqueas y bacterias identifica una nueva arquea asociada con la enfermedad de la banda negra en los corales. Reinar. Microbiol. 15, 2994–3007 (2013).

CAS PubMed Google Académico

Richardson, LL Patrones de migración horizontal y vertical de Phorrnidium corallyticum y Beggiatoa spp. asociado con la enfermedad de la banda negra de los corales. Microbio. Ecol. 32, 323–335 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Richardson, L. et al. Sulfuro, microcistina y la etiología de la enfermedad de la banda negra. Dis. agua Organo. 87, 79–90 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Richardson, LL et al. La presencia de la toxina cianobacteriana microcistina en la enfermedad de banda negra de los corales. FEMS Microbiol. Letón. 272, 182–187 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cooney, RP et al. Caracterización del consorcio bacteriano asociado a la enfermedad de banda negra en coral mediante técnicas de microbiología molecular. Reinar. Microbiol. 4, 401–413 (2002).

Artículo PubMed Google Académico

Frias-Lopez, J., Klaus, JS, Bonheyo, GT & Fouke, BW Comunidad bacteriana asociada con la enfermedad de banda negra en corales. aplicación Reinar. Microbiol. 70, 5955–5962 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Viehman, S., Mills, DK, Meichel, GW & Richardson, LL Cultivo e identificación de Desulfovibrio spp. de corales infectados por la enfermedad de la banda negra en los arrecifes de los Cayos de Florida y Dominicana. Dis. agua Organo. 69, 119–127 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Barneah, O., Ben-Dov, E., Kramarsky-Winter, E. y Kushmaro, A. Caracterización de la enfermedad de la banda negra en los corales pedregosos del Mar Rojo. Reinar. Microbiol. 9, 1995–2006 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hadaidi, G. et al. Caracterización ecológica y molecular de un brote de la enfermedad de la banda negra del coral en el Mar Rojo durante un evento de blanqueamiento. PeerJ 6, e5169 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Arotsker, L., Kramarsky-Winter, E., Ben-Dov, E., Siboni, N. y Kushmaro, A. Cambios en la comunidad bacteriana asociados con la enfermedad de banda negra en un coral del Mar Rojo, Favia sp., en relación a las fases de la enfermedad. Dis. agua Organo. 116, 47–58 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Snaidr, J., Amann, R., Huber, I., Ludwig, W. & Schleifer, KH Análisis filogenético e identificación in situ de bacterias en lodos activados. aplicación Reinar. Microbiol. 63, 2884–2896 (1997).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daims, H., Brühl, A., Amann, R., Schleifer, KH y Wagner, M. La sonda de dominio específico EUB338 es insuficiente para la detección de todas las bacterias: desarrollo y evaluación de un conjunto de sondas más completo. sist. aplicación Microbiol. 22, 434–444 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wada, N. et al. Visualización in situ de poblaciones bacterianas en tejidos de coral: trampas y soluciones. PeerJ 4, e2424 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wada, N., Kawamoto, T., Sato, Y. & Mano, N. Una aplicación novedosa de una técnica de criosección a especímenes de coral no descalcificados. Mar Biol. 163, 117 (2016).

Artículo Google Académico

Waite, DW et al. Análisis genómico comparativo de la clase Epsilonproteobacteria y reclasificación propuesta a Epsilonbacteraeota (phyl. nov.). Frente. Microbiol. 8, 682 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Pérez-Cataluña, A. et al. Revisando la Taxonomía del Género Arcobacter: Obtener Orden del Caos. Frente. Microbiol. 9, 2077 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

On, SLW, Miller, WG, Biggs, PJ, Cornelius, AJ & Vandamme, P. Aliarcobacter, Halarcobacter, Malaciobacter, Pseudarcobacter y Poseidonibacter son sinónimos posteriores de Arcobacter: transferencia de Poseidonibacter parvus, Poseidonibacter antarcticus, "Halarcobacter arenosus" y " Aliarcobacter vitoriensis" a Arcobacter como Arcobacter parvus comb. noviembre, Arcobacter antarcticus peine. nov., Peine Arcobacter arenosus. nov. y arcobacter vitoriensis peine. nov. En t. Sistema J. Evol. Microbiol. 71, 005133 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Meyer, JL, Paul, VJ, Raymundo, LJ & Teplitski, M. Metagenómica comparativa de la enfermedad polimicrobiana de la banda negra de los corales. Frente. Microbiol. 8, 618 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sato, Y. et al. Desentrañar los procesos microbianos de la enfermedad de la banda negra en los corales a través de la genómica integrada. ciencia Rep. 7, 40455 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramees, TP et al. Arcobacter: un patógeno zoonótico emergente transmitido por los alimentos, sus problemas de salud pública y los avances en el diagnóstico y el control: una revisión exhaustiva. Veterinario. P. 37, 136–161 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Glas, MS, Sato, Y., Ulstrup, KE y Bourne, DG Las condiciones biogeoquímicas determinan la virulencia de la enfermedad de la banda negra en los corales. ISME J. 6, 1526-1534 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Callbeck, CM et al. Arcobacter peruensis sp. nov., un quimiolitoheterótrofo aislado de aguas costeras ricas en sulfuro y materia orgánica frente a las costas de Perú. aplicación Reinar. Microbiol. 85, e01344–19 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wirsen, CO et al. Caracterización de un Arcobacter sp. marino oxidante de sulfuro autótrofo. Que Produce Azufre Filamentoso. aplicación Reinar. Microbiol. 68, 316–325 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roalkvam, I. et al. La caracterización fisiológica y genómica de Arcobacter anaerophilus IR-1 revela nuevas características metabólicas en Epsilonproteobacteria. Frente. Microbiol. 6, 987 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Akerman, NH, Butterfield, DA & Huber, JA Diversidad filogenética y patrones genéticos funcionales de las Epsilonproteobacterias submarinas oxidantes de azufre en fluidos de respiraderos hidrotermales difusos. Frente. Microbiol. 4, 185 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sievert, SM, Wieringa, EBA, Wirsen, CO y Taylor, CD Crecimiento y mecanismo de formación de azufre filamentoso por Candidatus Arcobacter sulfidicus en gradientes opuestos de sulfuro de oxígeno. Reinar. Microbiol. 9, 271–276 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kamarisima, Hidaka, K., Miyanaga, K. & Tanji, Y. La presencia de bacterias reductoras de nitrato y sulfato contribuye a la ineficacia del control de acidificación mediante inyección de nitrato. En t. Biodeterioro. Biodegradable 129, 81–88 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Sunagawa, S. et al. Diversidad bacteriana y cambios en la comunidad asociados a la enfermedad de la peste blanca en el coral caribeño Montastraea faveolata. ISME J. 3, 512–521 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sweet, M. & Bythell, J. Comunidades ciliadas y bacterianas asociadas con el síndrome blanco y la enfermedad de la banda marrón en corales formadores de arrecifes. Reinar. Microbiol. 14, 2184–2199 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Becker, CC, Brandt, M., Miller, CA y Apprill, A. Bioindicadores microbianos de la enfermedad de pérdida de tejido del coral pétreo identificados en corales y aguas suprayacentes utilizando un enfoque de secuenciación rápida basada en el campo. Reinar. Microbiol. 24, 1166–1182 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Brückner, V. et al. Caracterización de las cepas de Arcobacter aisladas de muestras de heces humanas: resultados del estudio prospectivo de prevalencia alemán Arcopath. Gut Pathog. 12, 3 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Ho, HTK et al. Interacción de Arcobacter spp. con células epiteliales intestinales humanas y porcinas. FEMS Inmunol. Medicina. Microbiol. 50, 51–58 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zambri, M. et al. Nuevos ensayos basados ​​en PCR de virulencia, resistencia a antibióticos y genes específicos de toxinas para la evaluación rápida de la patogenicidad de Arcobacter faecis y Arcobacter lanthieri. BMC Microbiol. 19, 11 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Levican, A., Alkeskas, A., Günter, C., Forsythe, SJ & Figueras, MJ Adherencia e invasión de células intestinales humanas por especies de Arcobacter y sus genotipos de virulencia. aplicación Reinar. Microbiol. 79, 4951–4957 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bjarnsholt, T. El papel de las biopelículas bacterianas en las infecciones crónicas. Suplemento APMIS 1–51, https://doi.org/10.1111/apm.12099 (2013).

Woelber, JP, Al-Ahmad, A. & Alt, KW Sobre la patogenicidad de la biopelícula oral: una revisión crítica desde un punto de vista biológico, evolutivo y nutricional. Nutrientes 14, 2174 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kolenbrander, PE, Ganeshkumar, N., Cassels, FJ y Hughes, CV Coagregación: adherencia específica entre las bacterias de la placa oral humana. FASEB J. 7, 406–413 (1993).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Peters, BM, Jabra-Rizk, MA, O'May, GA, Costerton, JW y Shirtliff, ME Interacciones polimicrobianas: impacto en la patogenia y la enfermedad humana. clin. Microbiol. Rev. 25, 193–213 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Rosenberg, E. & Falkovitz, L. El sistema modelo Vibrio shiloi/Oculina patagonica de blanqueamiento de corales. año Rev. Microbiol. 58, 143–159 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Vezzulli, L. et al. Infecciones por Vibrio que desencadenan eventos de mortalidad masiva en un mar Mediterráneo en calentamiento. Reinar. Microbiol. 12, 2007-2019 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Schindelin, J. et al. Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Nat. Métodos 9, 676–682 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Equipo central R. R: un lenguaje y entorno para la computación estadística. Viena, Austria: R Foundations for Statistical Computing. https://www.R-project.org/ (2020).

Caporaso, JG et al. QIIME permite el análisis de datos de secuenciación comunitaria de alto rendimiento. Nat. Métodos 7, 335–336 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schloss, PD et al. Presentamos mothur: software de código abierto, independiente de la plataforma y respaldado por la comunidad para describir y comparar comunidades microbianas. aplicación Reinar. Microbiol. 75, 7537–7541 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Edgar, RC Buscar y agrupar órdenes de magnitud más rápido que BLAST. Bioinformática 26, 2460–2461 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Quast, C. et al. El proyecto de base de datos de genes de ARN ribosomal SILVA: procesamiento de datos mejorado y herramientas basadas en la web. Ácidos nucleicos Res 41, D590–D596 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

McMurdie, PJ & Holmes, S. phyloseq: Un paquete R para análisis y gráficos interactivos reproducibles de datos de censos de microbiomas. PLoS One 8, e61217 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oksanen, J. et al. Vegano: Paquete de Ecología Comunitaria. https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html (2020).

Lahti, L. & Shetty, S. Paquete Microbiome R. http://microbioma.github.io/ (2012).

Amann, RI et al. Combinación de sondas de oligonucleótidos dirigidas a ARNr 16S con citometría de flujo para analizar poblaciones microbianas mixtas. aplicación Reinar. Microbiol. 56, 1919-1925 (1990).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nawrocki, EP & Eddy, SR Infernal 1.1: búsquedas de homología de ARN 100 veces más rápidas. Bioinformática 29, 2933–2935 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kozlov, AM, Darriba, D., Flouri, T., Morel, B. & Stamatakis, A. RAxML-NG: una herramienta rápida, escalable y fácil de usar para la inferencia filogenética de máxima verosimilitud. Bioinformática 35, 4453–4455 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berger, SA & Stamatakis, A. Alineación de lecturas cortas para referenciar alineaciones y árboles. Bioinformática 27, 2068–2075 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Barberá, P. et al. EPA-ng: Colocación evolutiva masivamente paralela de secuencias genéticas. sist. Biol. 68, 365–369 (2019).

Artículo PubMed Google Académico

Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v4: actualizaciones recientes y nuevos desarrollos. Ácidos Nucleicos Res. 47, W256–W259 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wallner, G., Amann, R. y Beisker, W. Optimización de la hibridación in situ fluorescente con sondas de oligonucleótidos dirigidas a ARNr para la identificación por citometría de flujo de microorganismos. Citometría 14, 136–143 (1993).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kapur, JN, Sahoo, PK y Wong, AKC Un nuevo método para el umbral de imagen de nivel de gris usando la entropía del histograma. computar Vis., Graph., imagen Proceso. 29, 273–285 (1985).

Artículo Google Académico

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Esta investigación fue apoyada por Grant-in-Aid for JSPS Fellows DC1 26•6085 y financiamiento de Academia Sinica. NW agradece amablemente al Dr. Kataaki Okubo, al Dr. Yukika Kawabata-Sakata y al difunto Sr. Kiyoshi Nakasone por el apoyo técnico en imágenes de microscopio confocal y alentar la motivación de NW para su doctorado. NW también agradece tanto a su difunto padre como a su madre por abrirle las puertas de oportunidades para investigar. NW espero sinceramente que su viaje vaya bien en el cielo.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Sen-Lin Tang, Nobuhiro Mano.

Centro de Investigación de Biodiversidad, Academia Sinica, No.128, Sec 2, Academia Rd, Nangang, Taipei, 11529, Taiwán

Naohisa Wada y Sen-Lin Tang

Departamento de Ciencias y Recursos Marinos, Facultad de Ciencias de Biorecursos, Universidad de Nihon, Fujisawa, Kanagawa, 252-0813, Japón

Naohisa Wada, Yuta Urabe, Natsumi Abe, Kazuki Takase, Shuji Hayashi, Saeko Kawanabe y Nobuhiro Mano

Servicio Geológico de Japón, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (AIST), 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8567, Japón

Akira Iguchi

Laboratorio de Investigación sobre Desarrollos y Tecnologías Ambientalmente Conscientes [E-code], Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (AIST), Tsukuba, 305-8567, Japón

Akira Iguchi

Departamento de Ingeniería de Biorecursos, Instituto Nacional de Tecnología, Okinawa College, 905 Henoko, Nago-City, Okinawa, 905-2192, Japón

yuki yoshioka

Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad James Cook, Townsville, Queensland, 4811, Australia

yui sato

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NW y NM concibió el estudio. NW, YU, NA, KT, SH y SK realizaron el muestreo archivado, incluida la medición de la tasa de migración de BBD. NW y YU realizaron la observación SEM. NW, AI y YY llevaron a cabo el procesamiento molecular y el análisis bioinformático y estadístico de los datos de secuencia. NW llevó a cabo el trabajo histológico, la observación FISH y el análisis estadístico. NW y S.-LT tuvieron una contribución importante en la redacción del manuscrito y la creación de figuras. AI, YS y NM contribuyeron a escribir y editar el manuscrito. S.-LT y NM son co-autores correspondientes del manuscrito. Todos los autores revisados ​​críticamente.

Correspondencia con Sen-Lin Tang o Nobuhiro Mano.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wada, N., Iguchi, A., Urabe, Y. et al. Las composiciones de la alfombra microbiana y los patrones de localización explican la virulencia de la enfermedad de la banda negra en los corales. npj Biofilms Microbiomas 9, 15 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00381-9

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Recibido: 06 Octubre 2022

Aceptado: 13 de marzo de 2023

Publicado: 04 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00381-9

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