Espaciotemporal

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4906 (2022) Citar este artículo

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Los enfoques de etiquetado de proximidad basados ​​en enzimas basados ​​en ésteres activados o radicales fenoxi se han utilizado ampliamente para mapear interactuadores de proteínas y proteomas subcelulares en células vivas. Sin embargo, los ésteres activados son poco reactivos, lo que conduce a un amplio radio de marcaje y los radicales fenoxi generados por el tratamiento con peróxido pueden alterar las vías sensibles a redox. Aquí, informamos un método de etiquetado de proximidad dependiente de la fotoactivación (PDPL) diseñado mediante la unión genética de la proteína fotosensibilizador miniSOG a una proteína de interés. Activado por la luz azul y sintonizado por el tiempo de irradiación, se genera oxígeno singulete, lo que permite a partir de entonces el etiquetado de la sonda de anilina resuelta espaciotemporalmente de los residuos de histidina. Demostramos su alta fidelidad mediante el mapeo de proteomas específicos de orgánulos. La comparación lado a lado de PDPL con TurboID revela una cobertura proteómica más específica y profunda de PDPL. Además, aplicamos PDPL al coactivador transcripcional relacionado con la enfermedad BRD4 y E3 ligasa Parkin, y descubrimos interactores previamente desconocidos. A través de la detección de sobreexpresión, se identifican dos sustratos no informados Ssu72 y SNW1 para Parkin, cuyos procesos de degradación están mediados por la vía de ubiquitinación-proteosoma.

La caracterización precisa de las redes de proteínas sustenta muchos procesos celulares fundamentales1. Por lo tanto, el mapeo espacio-temporal de alta fidelidad de las interacciones de proteínas proporcionaría una base molecular para descifrar vías biológicas, patologías de enfermedades, así como el potencial para perturbar estas interacciones con fines terapéuticos2. Con este fin, se necesitan métodos que puedan detectar interacciones transitorias en células o tejidos vivos. Históricamente, la espectrometría de masas de purificación por afinidad (AP-MS) se usaba para reducir los socios de unión de una proteína de interés (POI). Con los avances en los enfoques proteómicos cuantitativos, se ha establecido la base de datos de red de proteínas más grande, Bioplex3.0, basada en AP-MS3. Si bien AP-MS es extremadamente potente, la lisis celular y los pasos de dilución en el flujo de trabajo sesgan las interacciones de unión débiles y transitorias e introducen los artefactos posteriores a la lisis, como pares que interactúan espuriamente sin compartimentación antes de la lisis4.

En un intento por abordar estos desafíos, se han desarrollado aminoácidos no naturales (UAA) con grupos de entrecruzamiento y plataformas de etiquetado de proximidad enzimática (PL) (p. ej., APEX y BioID)5. Si bien los métodos de UAA se han aplicado con éxito en muchos escenarios y brindan información sobre los aglutinantes directos de proteínas6, aún requiere la optimización de los sitios de inserción de UAA. Más importante aún, es un método de marcaje estequiométrico que carece de rotación catalítica del evento de marcaje. Por el contrario, los métodos enzimáticos de PL, como el método BioID, fusionan una ligasa de biotina diseñada con el POI7, con la activación posterior de la biotina para generar el intermediario éster biotinoil-AMP reactivo. Como tal, la enzima cataliza y libera una "nube" de biotina activada, que marca los residuos de lisina proximales. Sin embargo, BioID requiere más de 12 h para obtener suficiente señal de marcaje, lo que impide su aplicación de forma resuelta temporalmente. Utilizando evolución dirigida basada en pantalla de levadura, TurboID fue diseñado a partir de BioID con una eficiencia mucho mayor, logrando un etiquetado efectivo de biotina en 10 min8, lo que hace posible estudiar procesos más dinámicos. Dado que TurboID es altamente activo y los niveles endógenos de biotina son suficientes para el etiquetado de bajo nivel, el etiquetado de fondo se convierte en una preocupación potencial cuando se requiere un etiquetado fuertemente mejorado y regulado en el tiempo mediante la adición de biotina exógena. Además, las especies de ésteres activados son poco reactivas (t1/2 ~5 min), lo que puede conducir a un amplio radio de marcaje, particularmente después de la saturación de las proteínas vecinas con biotina5. En un enfoque diferente, una fusión genética de peroxidasa de ácido ascórbico diseñada (es decir, APEX) genera radicales de biotina-fenol al activarse con H2O2 y logra el marcaje de proteínas en un minuto9,10. APEX se ha utilizado ampliamente para identificar proteomas subcelulares, complejos de proteínas de membrana y complejos de proteínas de señalización citosólica11,12. Sin embargo, el requerimiento de altas concentraciones de peróxido puede afectar las proteínas o vías sensibles a redox, perturbando los procesos celulares.

Por lo tanto, los nuevos métodos que pueden generar más especies reactivas para restringir el radio de etiquetado con alta fidelidad espacial y temporal y sin perturbaciones significativas en las vías celulares serían un complemento importante para los métodos actuales. Entre las especies reactivas, el oxígeno singlete despertó nuestra atención debido a su corta vida útil y radio de difusión limitado (t1/2 < 0,6 µs en las células)13. Se ha informado que el oxígeno singlete oxida promiscuamente la metionina, la tirosina, la histidina y el triptófano para anular su polaridad14,15, que se ligan con sondas basadas en amina o tiol16,17. Aunque el oxígeno singulete se ha aplicado en el etiquetado de ARN en compartimentos subcelulares18, la reutilización de la estrategia en el etiquetado de proximidad de puntos de interés endógenos sigue sin explotarse. En este documento, presentamos una plataforma llamada etiquetado de proximidad dependiente de la fotoactivación (PDPL), en la que usamos luz azul para iluminar un punto de interés fusionado con miniSOG fotosensibilizador y desencadenar la generación de oxígeno singulete para oxidar los residuos proximales, seguido de la modificación de los intermedios oxidados con una amina que contiene sonda química en células vivas. Examinamos un panel de sondas químicas para maximizar la especificidad del etiquetado y determinar los sitios de modificación utilizando un flujo de trabajo de proteómica de búsqueda abierta. Una comparación lado a lado de PDPL con TurboID revela una cobertura proteómica más específica y profunda de PDPL. Aplicamos este enfoque al etiquetado específico de orgánulos de proteomas subcelulares y la identificación en todo el proteoma de socios de unión para la proteína reguladora epigenética relacionada con el cáncer BRD4 y la E3 ligasa Parkin relacionada con la enfermedad de Parkinson, que valida una red de interactores de proteínas conocidos y no informados. La capacidad de PDPL para identificar sustratos E3 dentro del gran tamaño de los complejos de proteínas representa un escenario en el que se requiere la identificación de aglutinantes indirectos. Se validan in situ dos sustratos de Parkin no informados mediados por la vía de ubiquitinación-proteosoma.

La terapia fotodinámica (PDT)19 y la inactivación láser asistida por cromóforos (CALI)20, en las que el oxígeno singulete se produce mediante la fotoirradiación del fotosensibilizador, pueden inactivar las proteínas diana o desencadenar la muerte celular. Como el oxígeno singulete es una especie altamente reactiva con una distancia de difusión teórica de ~70 nm17,18,21, la oxidación restringida espacialmente puede controlarse alrededor del fotosensibilizador. Basándonos en este concepto, decidimos aprovechar el oxígeno singlete para lograr el etiquetado de proximidad de complejos proteicos en células vivas. Diseñamos el método proteómico químico PDPL para incorporar cuatro características: (1) generación catalítica de oxígeno singlete reactivo de manera similar a los enfoques PL enzimáticos; (2) proporcionar un etiquetado resuelto temporalmente por iniciación a través de iluminación ligera; (3) permitir el etiquetado resuelto espacialmente alterando el tiempo de irradiación para ajustar el radio de etiquetado; (4) evitar el uso de cofactores endógenos (p. ej., biotina) para reducir el fondo o el uso de reactivos exógenos altamente perturbadores (p. ej., peróxidos) para minimizar el impacto en el entorno celular.

Los fotosensibilizadores se pueden dividir en dos categorías, incluidos los fluoróforos basados ​​en moléculas pequeñas (p. ej., rosa de bengala, azul de metileno)22 y proteínas pequeñas codificadas genéticamente (p. ej., miniSOG, KillerRed)23. Para permitir un diseño modular, desarrollamos la plataforma PDPL de primera generación agregando una proteína fotosensibilizadora (PS)24,25 al PDI (Fig. 1a). Después de la iluminación con luz azul, el oxígeno singulete oxida los residuos de aminoácidos nucleofílicos proximales, lo que da como resultado una polaridad unpolung, que es electrofílica y puede reaccionar aún más con un nucleófilo de sonda de amina16,17. Las sondas están diseñadas con un mango de alquino, lo que permite la química de clic y el despliegue para la caracterización LC-MS/MS.

un esquema del etiquetado complejo de proteínas mediado por miniSOG. En la iluminación con luz azul, las células que expresan miniSOG-POI generan oxígeno singulete, que modifica las proteínas que interactúan en lugar de las proteínas que no se unen. El intermedio de fotooxidación es interceptado por el marcaje de relé de sonda química de amina para formar un aducto covalente. El grupo alquino en la sonda química permite la química de clic para el enriquecimiento desplegable, seguido de un análisis cuantitativo por LC-MS/MS. b La estructura química de las sondas de amina 1-4. c Análisis de gel fluorescente representativo del marcaje proteómico mediado por miniSOG localizado en mitocondrias con las sondas 1-4, así como la cuantificación relativa basada en la densitometría en gel. Se usaron experimentos de control negativo que omitieron la luz azul o con células HEK293T sin expresión miniSOG para evaluar el marcaje de señal a fondo de las sondas químicas. n = 2 muestras biológicamente independientes. Cada punto representa una réplica biológica. d Detección y cuantificación representativas de PDPL usando la sonda optimizada 3 en presencia o ausencia de los componentes de PDPL indicados similares a c. n = 3 muestras biológicamente independientes. Cada punto representa una réplica biológica. La línea central y los bigotes denotan la media y ±SD. CBB: azul coomassie brillante. e Imágenes confocales de oxígeno singulete mediante tinte rojo lejano Si-DMA. Barra de escala: 10 µm. Los experimentos confocales y de formación de imágenes en gel se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares.

Comenzamos probando los fotosensibilizadores bien desarrollados miniSOG26 y KillerRed23 expresados ​​​​establemente en HEK293T por su capacidad para mediar en el etiquetado proteómico, con propargilamina como sonda química (Fig. 1a complementaria). El análisis de fluorescencia en gel reveló que el etiquetado de todo el proteoma se logró con miniSOG e iluminación con luz azul, mientras que no se observaron productos de etiquetado obvios para KillerRed. Para aumentar la relación señal-fondo, probamos a continuación un panel de sondas químicas que contenían anilina (1 y 3), propilamina (2) o bencilamina (4). Notamos que las células HEK293T solas tienen una señal de fondo más alta en relación con la omisión de la luz azul, presumiblemente debido al fotosensibilizador endógeno riboflavina, mononucleótido de flavina (FMN)27. Las sondas químicas 1 y 3 basadas en anilina dieron una mejor especificidad, con HEK293T expresando miniSOG de manera estable en las mitocondrias mostrando un aumento de > 8 veces en la señal para la sonda 3, mientras que la sonda 2 utilizada en el método de etiquetado de ARN CAP-seq solo mostró ~2.5- aumento de la señal de veces, probablemente debido a las diferentes preferencias de reactividad entre el ARN y la proteína (Fig. 1b, c). Además, también se probaron los isómeros de la sonda 3 y la sonda de hidrazina (sonda 5, 6, 7), lo que confirmó que la sonda 3 es la optimizada (Fig. 1b, c complementarias). Del mismo modo, el análisis de fluorescencia en gel determinó otros parámetros experimentales optimizados: longitud de onda de iluminación (460 nm), concentración de sonda química (1 mM) y tiempo de iluminación (20 min) (Fig. 2a-c complementaria). La omisión de cualquier componente o paso en el protocolo PDPL resultó en una reversión significativa de la señal al fondo (Fig. 1d). En particular, el marcaje de proteínas se redujo en gran medida en presencia de azida de sodio o trolox, que se sabe que eliminan el oxígeno singulete28. La presencia de D2O, conocida por estabilizar el oxígeno singulete, mejoró la señal de marcaje. Para investigar la contribución de otras especies reactivas de oxígeno al etiquetado, se agregaron manitol y vitamina C, eliminadores de radicales hidroxilo y radicales superóxido respectivamente18,29, pero no se encontró que reduzcan el etiquetado. La adición de H2O2 en lugar de iluminación no logró generar el etiquetado (Fig. 3a complementaria). Las imágenes fluorescentes de oxígeno singulete mediante la sonda Si-DMA confirmaron la presencia de oxígeno singulete en la línea HEK293T-miniSOG, pero no en la línea original HEK293T. Además, mitoSOX Red no pudo detectar la generación de superóxido después de la iluminación (Fig. 1e y Fig. 3b complementaria)30. Estos datos indican claramente que el oxígeno singulete es el ROS principal que da lugar al posterior marcaje del proteoma. Se evaluó la citotoxicidad de PDPL, incluida la iluminación con luz azul y el tratamiento con sonda química, y no se observó una citotoxicidad significativa (Fig. 4a complementaria).

Para explorar el mecanismo de etiquetado y lograr la identificación proteómica de los complejos de proteínas mediante LC-MS/MS, primero necesitábamos determinar qué aminoácidos se modificaron y la masa delta del etiquetado de la sonda. Se ha informado que la metionina, la histidina, el triptófano y la tirosina son modificados por el oxígeno singlete14,15. Integramos el flujo de trabajo TOP-ABPP31 con la búsqueda abierta imparcial habilitada por la plataforma computacional FragPipe basada en MSFragger32. Después de la modificación del oxígeno singulete y el etiquetado de la sonda química, se usó una etiqueta de recuperación de biotina que contenía un conector escindible para la química del clic, seguida de la digestión con neutravidina y tripsina. Los péptidos modificados, aún unidos a la resina, se fotoescindieron para el análisis LC-MS/MS (Fig. 2a y Datos complementarios 1). Se enumeran las masas de modificación que ocurren en todo el proteoma con más de 50 coincidencias de espectro de péptidos (PSM) (Fig. 2b). Sorprendentemente, solo observamos modificaciones en la histidina, presumiblemente debido a la alta reactividad de la histidina oxidada hacia la sonda de anilina sobre otros aminoácidos. De acuerdo con el mecanismo publicado de oxidación de histidina por oxígeno singlete21,33, la estructura putativa para la masa delta +229 Da corresponde al aducto para la sonda 3 con 2-oxo-histidina después de doble oxidación, mientras que +247 Da es el producto de hidrólisis de + 229 Da (Fig. 5 complementaria). La evaluación de los espectros de MS2 muestra una identificación de alta confianza de una gran fracción de iones y e iones b, incluidos los iones de fragmento (y y b) que permitieron la identificación de la modificación (Fig. 2c). El análisis del contexto de la secuencia local de las histidinas modificadas con PDPL reveló una modesta preferencia de motivo por los residuos hidrofóbicos pequeños en la posición ± 1 (Fig. 4b complementaria). En promedio, se identificaron 1.4 histidinas por proteína y estos sitios marcados están bien expuestos determinados por el análisis del área de superficie accesible al solvente (SASA) y la accesibilidad relativa del solvente (RSA) (Figura complementaria 4c, d).

a Un flujo de trabajo imparcial para estudiar la selectividad de residuos usando la plataforma computacional FragPipe basada en MSFragger. Se utilizó un conector escindible para la química Click, que permite la fotoescisión del péptido modificado de la resina de estreptavidina. Se desplegó una búsqueda abierta para identificar las masas de modificación así como los residuos correspondientes. b Se asignan las masas de modificación que ocurren en todo el proteoma. Coincidencias de espectro de péptidos de PSM. c Anotación del espectro MS2 de un sitio de histidina modificado con sonda 3. La reacción covalente con la sonda 3 añade +229,0938 Da al aminoácido modificado como ejemplo representativo. d Ensayo de mutación para validar el etiquetado de PDPL. PRDX3 (H155A, H225A) y PRDX1 (H10A, H81A, H169A) se transfectaron junto con sus plásmidos de tipo salvaje para la detección anti-Flag. e Se hizo reaccionar un péptido sintético con miniSOG purificado en presencia de la sonda 3 y se anotó el producto correspondiente con Δm +247 y +229 en el espectro de LC-MS. f Interacción proteína-proteína in vitro simulada por miniSOG-6xHis-tag y anticuerpo anti-6xHis. Análisis de transferencia Western anti-biotina (estreptavidina-HRP) y anti-ratón del complejo de anticuerpo miniSOG-6xHis/anti-6xHis marcado con sonda 3 contra el tiempo de irradiación de luz. El marcaje de proteínas individuales se indica en pesos moleculares apropiados: cadena ligera de anticuerpo LC; cadena pesada HC del anticuerpo. Estos experimentos se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares.

Para validar bioquímicamente los sitios de marcaje, las histidinas de PRDX3 y PRDX1 identificadas en espectrometría de masas se mutaron a alanina y se compararon con las de tipo salvaje en un ensayo de transfección. Los resultados de PDPL mostraron que las mutaciones reducen significativamente el etiquetado (Fig. 2d). Mientras tanto, una secuencia peptídica identificada en la búsqueda abierta se sintetizó y reaccionó in vitro con miniSOG purificado en presencia de la sonda 3 y luz azul, con productos con desplazamiento de masa +247 y +229 Da que aparecen en la detección de LC-MS (Fig. 2e ). Para probar si los interactores de proteínas proximales podrían etiquetarse en respuesta a la fotoactivación de miniSOG in vitro, construimos un ensayo de proximidad artificial a través de la interacción entre la proteína miniSOG-6xHis y el anticuerpo monoclonal anti-His in vitro (Fig. 2f). En este ensayo, esperábamos el etiquetado proximal de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo por parte de miniSOG. De hecho, el anti-ratón (que reconoce tanto las cadenas pesadas como las ligeras del anticuerpo anti-etiqueta 6xHis) y el Western blot de estreptavidina revelaron una sólida biotinilación de las cadenas pesadas y ligeras. En particular, notamos la auto-biotinilación de miniSOG debido a la etiqueta 6xHis, así como el entrecruzamiento entre la cadena ligera y la cadena pesada, presumiblemente debido a la reacción proximal entre la lisina y la 2-oxo-histidina, que se informó anteriormente34. En conjunto, llegamos a la conclusión de que PDPL modifica la histidina de una manera dependiente de la proximidad.

Nuestro próximo objetivo fue caracterizar los proteomas subcelulares para probar la especificidad de marcaje in situ. Por lo tanto, expresamos miniSOG de manera estable en el núcleo, la matriz mitocondrial o la membrana externa ER de las células HEK293T (Fig. 3a). El análisis de fluorescencia en gel reveló abundantes bandas de etiquetado, así como diferentes patrones de etiquetado en las tres ubicaciones subcelulares (Fig. 3b). El análisis de imágenes fluorescentes reveló una alta especificidad de PDPL (Fig. 3c). El flujo de trabajo de PDPL seguido de una reacción de clic con un tinte de rodamina se usó para delinear los proteomas subcelulares mediante microscopía de fluorescencia, con la señal de PDPL coubicándose con DAPI, rastreador mitocondrial o rastreador ER, validando la alta fidelidad de PDPL. Para tres ubicaciones de orgánulos, una comparación lado a lado de PDPL con TurboID utilizando transferencia Western anti-biotina reveló un etiquetado más específico por parte de PDPL en comparación con sus respectivos controles. Aparecieron más bandas de etiquetado en condiciones de PDPL, lo que indica más proteínas etiquetadas por PDPL (Fig. 6a-d complementaria).

un esquema del etiquetado proteómico específico de orgánulos mediado por miniSOG. miniSOG se dirige genéticamente a la matriz mitocondrial a través de la fusión con los 23 aminoácidos N-terminales de la COX4 humana (mito-miniSOG), al núcleo a través de la fusión con H2B (núcleo-miniSOG) y al lado citoplasmático de la membrana del RE a través de fusión a Sec61β (ER-miniSOG). La lectura incluye imágenes en gel, imágenes confocales y espectrometría de masas. b Imágenes de gel representativas de tres perfiles de PDPL específicos de orgánulos. CBB coomassie azul brillante. c Imágenes confocales representativas de células HEK293T que expresan de forma estable diferentes miniSOG localizados en subcelulares, que se detectaron con anticuerpo de etiqueta V5 (rojo). Los marcadores subcelulares se utilizan para mitocondrias y ER (verde). El flujo de trabajo de PDPL implica la química de clics con Cy3-azide para detectar los proteomas subcelulares marcados con miniSOG (amarillo). Barra de escala: 10 µm. d Gráficas volcánicas de proteomas marcados con PDPL en diferentes orgánulos cuantificados mediante cuantificación sin etiquetas (n = 3 experimentos biológicos independientes). Se usó una prueba t de Student de dos caras en la gráfica del volcán. Se usó HEK293T de tipo salvaje como control negativo. Las proteínas significativamente modificadas se resaltan en rojo (p < 0,05 y > 2 veces la diferencia de intensidad de iones). Las proteínas relevantes que son significativas en HEK293T-miniSOG pero no en HEK293T están marcadas en verde. e Análisis de especificidad para conjuntos de datos proteómicos derivados de experimentos en d. Los números totales de proteínas estadísticamente significativas en cada orgánulo (puntos rojos y verdes) se etiquetaron en la parte superior. Las barras muestran proteínas localizadas en orgánulos basadas en MitoCarta 3.0, análisis GO y A. Ting et. Alabama. conjunto de datos para mitocondrial, núcleo y ER, respectivamente. Estos experimentos se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Alentados por los resultados del gel y de las imágenes, se empleó la cuantificación sin etiquetas para cuantificar los proteomas identificados en cada orgánulo (Datos complementarios 2). Se usó HEK293T no transfectado como control negativo para deducir el marcaje de fondo. El análisis del gráfico del volcán mostró proteínas significativamente enriquecidas (p < 0,05 y > 2 veces la intensidad de los iones), así como proteínas únicas que solo están presentes en las líneas que expresan miniSOG (Fig. 3d, puntos rojos y verdes). Combinando estos datos, identificamos 1364, 461 y 911 proteínas estadísticamente significativas para el núcleo, las mitocondrias y la membrana externa del RE, respectivamente. Para analizar la precisión del PDPL localizado en orgánulos, utilizamos MitoCarta 3.0, análisis de ontología génica (GO) y A. Ting et al. dataset8 para mitocondrias, núcleos y ER para validar la especificidad de orgánulos de las proteínas detectadas, que correspondía a una precisión del 73,4, 78,5 y 73,0% (Fig. 3e). La especificidad de PDPL valida que PDPL es una herramienta ideal para identificar proteomas específicos de orgánulos. En particular, el análisis submitocondrial de las proteínas mitocondriales identificadas reveló que el proteoma capturado se distribuyó principalmente en la matriz y la membrana interna (226 y 106, respectivamente), lo que representa el 91,7 % del total de proteínas mitocondriales identificadas (362), lo que confirmó aún más la alta -fidelidad de PDPL (Fig. 7a complementaria). Del mismo modo, el análisis subnuclear reveló que el proteoma capturado se distribuyó predominantemente en el núcleo, el nucleoplasma y el nucléolo (Fig. 7b complementaria). El perfil del proteoma del núcleo mediante el péptido de señales de localización nuclear (3xNLS) reveló una precisión similar a la construcción H2B (Fig. 7c-h complementaria). Para definir la especificidad de marcaje de PDPL, se seleccionó Lamin A nuclear como un cebo de POI más discretamente localizado7. PDPL identificó 36 proteínas significativamente enriquecidas, con 12 proteínas (30,0%, incluida Lamin A) siendo proteínas que interactúan con Lamin A bien caracterizadas anotadas por la base de datos String, lo que representa un porcentaje más alto que el método BioID (28 de 122 proteínas, 22,9%) 7. Nuestro método identificó menos proteínas, probablemente debido al área de etiquetado restringida, habilitada por oxígeno singulete más reactivo. El análisis GO revela que las proteínas identificadas se encuentran principalmente en el nucleoplasma (26), la envoltura nuclear (10), la membrana nuclear (9) y el poro nuclear (5). Combinadas, estas proteínas localizadas en el núcleo representan el 80 % de las proteínas enriquecidas, lo que demuestra aún más la especificidad de PDPL (Fig. 8a-d complementaria).

Habiendo establecido la capacidad de PDPL para el etiquetado de proximidad en orgánulos, luego probamos si PDPL podría usarse para perfilar los socios vinculantes de un PDI. En particular, buscamos determinar el perfil de PDPL de las proteínas citosólicas, que se consideraban objetivos más difíciles en comparación con sus contrapartes localizadas en la membrana debido a su naturaleza altamente dinámica12. El bromodominio y la proteína extraterminal (BET) BRD4 despertaron nuestra atención por su papel crítico en una variedad de enfermedades35,36. Los complejos formados por BRD4 son coactivadores transcripcionales y dianas terapéuticas importantes. Al regular la expresión del factor de transcripción c-myc y Wnt5a, BRD4 se considera un determinante clave en la leucemia mieloide aguda (LMA), el mieloma múltiple, el linfoma de Burkitt, el cáncer de colon y las enfermedades inflamatorias37,38. Además, varios virus se dirigen a BRD4 para regular la transcripción viral y celular, como el virus del papiloma, el VIH y el SARS-CoV-236,39.

Para determinar un mapa de interacción de BRD4 usando PDPL, fusionamos miniSOG con la isoforma corta de BRD4 en el terminal N o C. Los resultados proteómicos revelaron una gran superposición entre las dos construcciones (Fig. 9a complementaria). El proteoma nuclear determinado por miniSOG-H2B cubrió el 77,6% de las proteínas que interactúan con BRD4 (Fig. 9b complementaria). Luego, se usaron diferentes puntos de tiempo de iluminación (2, 5, 10, 20 min) para regular el radio de etiquetado (Fig. 4a y Datos complementarios 3). Razonamos que en un tiempo de iluminación más corto, PDPL marcaría principalmente a los socios de unión directa, mientras que los tiempos largos incluirían proteínas identificadas en el período de fotoactivación más corto, así como también marcaría objetivos indirectos en complejos. De hecho, encontramos una gran superposición entre puntos de tiempo adyacentes (84,6 % para 2 vs. 5 min; 87,7 % para 5 vs. 10 min; 98,7 % para 10 vs. 20 min) (Fig. 4b y Fig. 9c complementaria). En todos los grupos experimentales, no solo detectamos el autoetiquetado de BRD4, sino también varios de sus objetivos conocidos, como MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A y HMGB1, como se indica en la base de datos String. La intensidad de iones de esos objetivos es proporcional al tiempo de iluminación (Fig. 4c y Fig. 9d complementaria). El análisis GO de las proteínas identificadas en el grupo de 2 min reveló que las proteínas identificadas están localizadas en el núcleo y participan en la remodelación de la cromatina y la función de la ARN polimerasa. Las funciones moleculares de las proteínas se enriquecieron en la unión a cromatina o la coactivación de la transcripción, de acuerdo con la función de BRD4 (Fig. 4d). El análisis de interacción de proteínas habilitado por la base de datos String reveló la primera capa de interacción indirecta entre BRD4 y los complejos de interacción de la familia HDAC como SIN3A, NCOR2, BCOR y SAP130 (Fig. 4e y Fig. 9e complementaria), en línea con BRD4 y HDAC. unión de histonas acetiladas. Además, los objetivos representativos que incluyen Sin3A, NSUN2, Fus y SFPQ identificados por LC-MS/MS fueron validados por Western blot (Fig. 4f). Recientemente, se informó que una isoforma corta de BRD4 forma puntos nucleares que poseen propiedades de separación de fases líquido-líquido (LLPS)40. Las proteínas de unión a ARN Fus y SFPQ, que median LLPS para una variedad de procesos celulares41, se identificaron aquí como proteínas de unión a BRD4 no reportadas. Los experimentos de coinmunoprecipitación (co-IP) verificaron la interacción entre BRD4 y SFPQ (Fig. 4g), lo que indica un mecanismo diferente de separación de fases líquido-líquido mediado por BRD4 y justifica una mayor investigación. En conjunto, estos resultados demuestran que PDPL es una plataforma ideal para identificar interactores BRD4 conocidos, así como proteínas de unión no informadas.

un esquema del etiquetado de proximidad BRD4 mediado por miniSOG con tiempo de irradiación: 2, 5, 10 y 20 min. b Superposición de las proteínas identificadas para diferentes puntos de tiempo de iluminación. El enriquecimiento de las proteínas identificadas es estadísticamente significativo en HEK293T-miniSOG-BRD4 en comparación con HEK293T de tipo salvaje. c La intensidad de iones en la cuantificación sin etiquetas para proteínas de unión a BRD4 conocidas y representativas a lo largo de los tiempos de irradiación indicados. n = 3 muestras biológicamente independientes. Los datos se presentan como valores medios ± SD. d Análisis de ontología génica (GO) de proteínas identificadas en el grupo de 2 min. Se enumeran los diez términos GO principales. Las burbujas están coloreadas según la clase de término GO y el tamaño de la burbuja es proporcional a la cantidad de proteínas que se encuentran en cada término. e Análisis de cadenas de proteínas que interactúan con BRD4. Los círculos amarillos son aglutinantes directos y los círculos grises están en la primera capa de aglutinantes indirectos. Las líneas rojas indican interacciones determinadas experimentalmente y las líneas cian indican interacciones predichas. f Los objetivos de unión a BRD4 representativos identificados en LC-MS/MS se validaron mediante Western blot. g Los experimentos de coinmunoprecipitación verificaron la interacción entre SFPQ y BRD4. Estos experimentos se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además de identificar objetivos de unión no informados de POI, imaginamos que PDPL sería adecuado para identificar sustratos de enzimas, lo que requiere la caracterización de proteínas de unión indirecta en un gran complejo para anotar sustratos no informados. Parkin (codificado por PARK2) es una ligasa E3, y se sabe que las mutaciones en Parkin causan la enfermedad de Parkinson juvenil autosómica recesiva (AR-JP)42. Además, se describe que Parkin es crucial para la mitofagia (autofagia de las mitocondrias) y la eliminación de especies reactivas de oxígeno43. Sin embargo, la función de Parkin en esta enfermedad no está clara a pesar de la identificación de varios de sus sustratos. Para anotar sus sustratos no caracterizados, se probó PDPL incorporando miniSOG en los extremos N o C de Parkin. Las células se trataron con protonóforo carbonilo cianuro m-clorofenil hidrazona (CCCP) para activar Parkin a través de la vía PINK1-Parkin. En contraste con nuestros resultados de BRD4 PDPL, la fusión N-terminal de Parkin identificó un conjunto mucho más grande de objetivos proteicos, aunque cubre la mayor parte del C-terminal (177 de 210) (Fig. 5a, b y Datos complementarios 4) . Este resultado está en línea con el informe de que el etiquetado N-terminal puede activar Parkin44 de manera aberrante. Sorprendentemente, nuestros datos tienen solo 18 proteínas superpuestas con los resultados AP-MS publicados para Parkin43, probablemente debido a las diferencias entre las líneas celulares y los flujos de trabajo proteómicos. PDPL pudo identificar exclusivamente 11 ligantes conocidos de Parkin (ATXN2, IKBKG, PSMD4, TP53, SUMO1, PSMD9, STUB1, PSMD4, DNAJB1, UBE2Z y EPS15), además de cuatro proteínas conocidas identificadas por ambos enfoques (ARDM1, HSPA8, PSMD14 , y PSMC3) (Fig. 5c)43. Para validar aún más los resultados de LC-MS/MS, se usaron el procesamiento de PDPL y el posterior análisis de transferencia Western para comparar los resultados desplegables de las células HEK293T parentales y la línea estable de Parkin N-terminal. Los objetivos previamente desconocidos CDK2, DUT, CTBP1 y PSMC4 se validaron junto con el aglutinante conocido DNAJB1 (Fig. 5d).

a Gráficos de volcán de proteínas que interactúan con Parkin en células HEK293T con miniSOG expresada de forma estable fusionada con el N-terminal o el C-terminal de Parkin (n = 3 experimentos biológicos independientes). Se usó una prueba t de Student de dos caras en la gráfica del volcán. HEK293T se utilizó como control negativo. Las proteínas significativamente modificadas se resaltan en rojo (p < 0,05 y > 2 veces la diferencia de intensidad de iones). Las proteínas relevantes que son significativas en HEK293T-miniSOG pero no en HEK293T están marcadas en verde. b Diagrama de Venn que muestra proteínas superpuestas entre construcciones N-terminal y C-terminal. El etiquetado N-terminal puede activar aberrantemente Parkin y conducir a proteínas más identificadas. c Diagrama de Venn que muestra proteínas superpuestas entre PDPL y AP-MS. Se enumeran los interactores conocidos, incluidas cuatro proteínas de 18 proteínas superpuestas, así como 11 proteínas de 159 identificadas exclusivamente en PDPL. d Los objetivos representativos identificados por LC-MS/MS se validaron mediante Western blot. e Ssu72 y SNW1 se identificaron como sustratos no informados de Parkin. Los plásmidos con estas proteínas marcadas con FLAG se transfectaron en HEK293T y HEK293T-Parkin-miniSOG, seguidos de tratamiento con CCCP en diferentes momentos. La degradación es más significativa en la línea de sobreexpresión de Parkin. f Se confirmó que el proceso de degradación de Ssu72 y SNW1 está mediado por la vía de ubiquitinación-proteasoma mediante el uso del inhibidor de proteasoma MG132. Estos experimentos se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En particular, las proteínas identificadas por PDPL deben incluir proteínas de unión de Parkin, así como sus sustratos. Para descubrir sustratos no informados de Parkin, seleccionamos siete proteínas identificadas (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 y SNW1) y plásmidos transfectados, mostrando estos genes en HEK293T normal y HEK293T que expresan establemente miniSOG-Parkin, seguidos de tratamiento CCCP. Los niveles de proteína Ssu72 y SNW1 se redujeron significativamente en las líneas estables miniSOG-Parkin (Fig. 5e). El tratamiento CCCP durante 12 h dio la degradación más significativa de ambos sustratos. Para investigar si la degradación de Ssu72 y SNW1 estaba regulada por la vía de ubiquitinación-proteasoma, se agregó el inhibidor de proteasoma MG132 para inhibir la actividad del proteasoma y, de hecho, encontramos que su proceso de degradación estaba inhibido (Fig. 5f). Los otros objetivos que no son de sustrato se validaron como interactuadores de Parkin utilizando Western blot (Fig. 10 complementaria), que mostró resultados consistentes con LC-MS/MS. En conjunto, la integración del flujo de trabajo de PDPL con la validación de la transfección de proteínas objetivo puede identificar sustratos no informados para las ligasas E3.

Hemos desarrollado una plataforma de etiquetado de proximidad general que permite la identificación resuelta espaciotemporalmente de los interactores de PDI. Esta plataforma se basa en la proteína fotosensibilizadora miniSOG, que tiene solo ~12 kD, menos de la mitad del tamaño de la enzima bien desarrollada APEX2 (27 kD) y un tercio del tamaño de TurboID (35 kD). El tamaño más pequeño debería ampliar en gran medida el ámbito de aplicación para estudiar el interactoma de proteínas pequeñas. Se justifica la exploración futura de fotosensibilizadores adicionales, tanto proteínas codificadas genéticamente como moléculas pequeñas45, para aumentar el rendimiento cuántico de oxígeno singulete y ampliar la sensibilidad de este enfoque. Para la versión miniSOG actual, el uso de iluminación de luz azul para iniciar el etiquetado de proximidad permite una alta resolución temporal. Además, los períodos de irradiación más largos liberan una "nube" más grande de oxígeno singulete, lo que conduce a la modificación de residuos de histidina más distales, lo que expande el radio de marcaje y permite un ajuste fino de la resolución espacial de PDPL. También examinamos siete sondas químicas para aumentar la relación señal-fondo y exploramos el mecanismo molecular subyacente a este enfoque. El flujo de trabajo TOP-ABPP junto con la búsqueda abierta imparcial confirmó que la modificación ocurrió solo en la histidina y no se observó un microambiente consistente para una mayor modificación de la histidina, además de una preferencia modesta por la histidina en las regiones del bucle.

PDPL también se utilizó para caracterizar proteomas subcelulares, donde la especificidad y la cobertura del proteoma eran al menos comparables con otros métodos de etiquetado de proximidad y métodos basados ​​en sondas químicas específicas de orgánulos. El marcaje de proximidad también se ha aplicado con éxito para caracterizar la superficie, el proteoma del lisosoma y los proteomas asociados a la vía secretora46,47. Creemos que PDPL sería compatible con estos orgánulos subcelulares. Además, desafiamos a PDPL con la identificación de objetivos de unión a proteínas citosólicas, que es más difícil que las proteínas unidas a la membrana debido a su naturaleza dinámica y su participación en interacciones más transitorias. Se aplicó PDPL a dos proteínas, el coactivador transcripcional BRD4 y la ligasa E3 relacionada con la enfermedad, Parkin. Estas dos proteínas fueron seleccionadas no solo por sus funciones biológicas básicas sino también por su relevancia clínica y potencial terapéutico. Se identificaron socios vinculantes conocidos, así como objetivos no informados, para ambos puntos de interés. En particular, una proteína SFPQ relacionada con la separación de fases fue validada por un co-IP, lo que puede indicar un nuevo mecanismo en el que BRD4 (isoforma corta) regula LLPS. Mientras tanto, la identificación de sustratos de Parkin, creemos, es un escenario en el que se requiere la identificación de aglutinantes indirectos. Identificamos dos sustratos de Parkin no informados y validamos su degradación por la vía de ubiquitinación-proteosoma. Muy recientemente, se desarrolló una estrategia de trampa basada en mecanismos para descubrir sustratos de hidrolasa al capturar los sustratos con la enzima48. Si bien es un enfoque extremadamente poderoso, no es adecuado para perfilar sustratos involucrados en la formación de grandes complejos y requiere la formación de un enlace covalente entre enzimas y sustratos. Anticipamos que PDPL podría expandirse al estudio de otros complejos de proteínas y familias de enzimas, como las familias de deubiquitinasa y metaloproteasa.

Se ha diseñado una nueva forma de miniSOG, denominada SOPP3, con un rendimiento de oxígeno singulete mejorado49. Comparamos miniSOG con SOPP3 y descubrimos que la eficiencia de etiquetado aumentó, aunque la relación señal-ruido permaneció sin cambios (Fig. 11 complementaria). Postulamos que la optimización de SOPP3 (por ejemplo, a través de la evolución dirigida) daría como resultado una proteína fotosensibilizadora más eficiente que requiere un tiempo de iluminación mucho más corto, lo que permite la captura de procesos celulares más dinámicos. En particular, la versión actual de PDPL se limita al entorno celular, ya que requiere iluminación de luz azul, que no es penetrable en los tejidos profundos. Esta característica impide su utilidad en estudios de modelos animales. Sin embargo, las tecnologías optogenéticas junto con PDPL podrían proporcionar una vía para el estudio en animales50, especialmente en el cerebro. Además, otros fotosensibilizadores infrarrojos diseñados también aliviarían esta limitación. La investigación en esta dirección está actualmente en curso.

La línea celular HEK293T se obtuvo de ATCC (CRL-3216). La línea celular resultó negativa para la contaminación por micoplasma y se cultivó en DMEM (Thermo, n.° C11995500BT) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Vistech, n.° SE100-B) y penicilina/estreptomicina al 1 % (Hyclone, n.° SV30010) .

3-aminofenileno (sonda 3) y (4-etinilfenil) metanamina (sonda 4) se adquirieron de Bidepharm. La propilamina (sonda 2) se adquirió de Energy-chemicals. La N-(2-aminofenil)pent-4-inamida (sonda 1) se sintetizó de acuerdo con un procedimiento publicado51.

La Tabla complementaria 1 enumera las construcciones genéticas utilizadas en este estudio. Las secuencias miniSOG y KillerRed se clonaron a partir de plásmidos de regalo de P. Zou (Universidad de Pekín). La secuencia dirigida a la matriz mitocondrial se derivó de los 23 aminoácidos N-terminales de COX4, luego se clonó en vectores específicos mediante el ensamblaje de Gibson (Beyotime, #D7010S). En cuanto a la orientación a la membrana y el núcleo del retículo endoplásmico, se utilizó ADN humano SEC61B (NM_006808.3) amplificado mediante PCR (NEB, #M0491L) de la biblioteca de ADNc de células HEK293T y ADN H2B (un regalo de D. Lin en el Laboratorio de la Bahía de Shenzhen) y clonado como arriba. Otros genes de proteínas utilizados en la transfección y la construcción de líneas celulares estables se amplificaron mediante PCR de la biblioteca de ADNc de células HEK293T, si no se menciona lo contrario. Se usaron G3S (GGGS) y G4S (GGGGS) como conectores entre la proteína cebo y miniSOG. Se añadió una etiqueta de epítopo V5 (GKPIPNPLLGLDST) a estas construcciones de fusión. Para la expresión en mamíferos y la creación de líneas celulares estables, se subclonaron construcciones de fusión miniSOG en un vector lentiviral pLX304. Para la expresión bacteriana, se clonó miniSOG en un vector pET21a con una etiqueta 6xHis en el extremo C-terminal.

Las células HEK293T se sembraron en una placa de seis pozos a 2,0 × 105 células por pozo y se transfectaron después de 24 h con un plásmido lentiviral recombinante (2,4 μg pLX304) y plásmidos de empaquetamiento de virus (1,5 μg psPAX2 y 1,2 μg pMD2.G) usando Lipo8000 ( Beyotime, #C0533) con una confluencia de ~80 %. Después de la transfección durante la noche, se cambiaron los medios y se dejaron incubar durante 24 h más. La colecta viral se realizó a las 24, 48 y 72 h. El medio viral se filtró con un filtro de 0,8 μm (Merck, #millex-GP) y se agregó Polybrene (Solarbio, #H8761) a una concentración de 8 μg/mL antes de la infección de las líneas celulares diana. Después de 24 h, se permitió que las células se recuperaran intercambiando los medios. Las células se seleccionaron con blasticidina (Solarbio, n.° 3513-03-9) a 5 μg/ml durante los tres primeros pases como una selección de menor rigurosidad. Luego, se emplearon 20 μg/mL como una rigurosidad más alta para los siguientes tres pases.

Las células se sembraron en una cámara de 12 pozos (Ibidi, #81201) a una densidad de ~20 000 células por pozo. Para mejorar la adherencia de las células HEK293T, las cámaras se pretrataron con 50 μg/ml de fibronectina (Corning, n.º 356008) diluida en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Sangon, n.º B640435) durante 1 h a 37 °C y se eliminó con PBS. Después de 24 h, las células se lavaron una vez con PBS, se incubaron con sonda 3 1 mM en solución salina equilibrada de Hanks fresca (HBSS, Gibco, n.° 14025092) durante 1 h a 37 °C y luego se iluminaron con LED azul (460 nm) durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con formaldehído al 4% (Sangon, #E672002) en PBS a temperatura ambiente durante 15 min. Se eliminó el exceso de formaldehído de las células fijadas mediante lavado con PBS tres veces. A continuación, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % (Sangon, nº A600198) en PBS y después se lavaron tres veces más con PBS. A continuación, se retiró la cámara y se agregaron 25 μL de mezcla de reactivos de reacción de clic a cada muestra, que contenía Cy3-azida 50 μM (Aladdin, n.° C196720), CuSO4 2 mM (Sangon, n.° A603008), BTTAA 1 mM (Confluore, n.° BDJ -4) y 0,5 mg/ml de ascorbato de sodio (Aladdin, #S105024), y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Después de la reacción de clic, las células se lavaron con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 % (Sangon, n.° A600560) (PBST) seis veces y luego se bloquearon con BSA al 5 % (Abcone, n.° B24726) en PBST durante 30 min a temperatura ambiente.

Para realizar la inmunotinción y permitir el análisis de colocalización, las células se incubaron con anticuerpos primarios de acuerdo con las condiciones indicadas: anticuerpo monoclonal de ratón anti-V5 tag (1:500, CST, #80076), anticuerpo monoclonal de conejo anti-Hsp60 (1:1000, ABclonal, #A0564), anticuerpo policlonal de conejo anti-calnexina (1:500, Abcam, #ab22595), o anticuerpo monoclonal de conejo anti-Lamin A/C (1:500; CST, #2032) durante la noche a 4 °C. Después de lavar con PBST tres veces, las células se incubaron con anticuerpo secundario: cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) a una dilución de 1:1000, cabra anti-ratón Alexa Fluor 594 (CST, #8889) a 1:1000 dilución durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron tres veces con PBST y se contrastaron con DAPI (Thermo, #D1306) en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se sellaron en glicerol al 50 % (Sangon, n.° A600232) en PBS para obtener imágenes después de lavarlas tres veces con PBS. Las imágenes de inmunofluorescencia se recogieron con el microscopio confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 con el software ZNE 3.5.

Para obtener imágenes fluorescentes del oxígeno singulete, las células se lavaron dos veces con tampón HEPES de Hanks, luego se añadió Si-DMA 100 nM (DOJINDO, #MT05) en tampón HEPES de Hanks. Después de la iluminación, las células se cultivaron durante 45 min en una incubadora de CO2 a 37 °C. A partir de entonces, las células se lavaron dos veces con tampón HEPES de Hanks y se contrastaron con Hoechst en tampón HEPES de Hanks durante 10 minutos a temperatura ambiente y se tomaron imágenes con un microscopio confocal ZEISS LSM 900. Para obtener imágenes fluorescentes de superóxido, se añadió a las células indicador rojo de superóxido mitocondrial MitoSOX™ 5 μM (Invitrogen, n.º M36008) en tampón HBSS que contenía calcio y magnesio. Después de la iluminación o el tratamiento con doxorrubicina (MCE, #HY-15142A), las células se cultivaron durante 10 min en una incubadora de CO2 a 37 °C, se lavaron dos veces con tampón HBSS y se contrastaron con Hoechst en tampón HBSS durante 10 min a temperatura ambiente. Se utilizó doxorrubicina como control positivo para la sonda en la que las células se trataron con doxorrubicina 20 μM en HBSS que contenía BSA al 1 % durante 30 min. Las imágenes de inmunofluorescencia se recogieron con el microscopio confocal ZEISS LSM 900.

Se sembraron células HEK293T que expresan mito-miniSOG de forma estable en placas de 15 cm a una densidad de ~30 %. Después de 48 h, cuando alcanzaron una confluencia de ~80 %, las células se lavaron una vez con PBS, se incubaron con sonda 3 1 mM en tampón HBSS fresco durante 1 h a 37 °C y luego se iluminaron con LED azul durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS, se rasparon y se resuspendieron en un tampón PBS enfriado con hielo que contenía inhibidor de proteasa libre de EDTA (MCE, # HY-K0011). Las células se lisaron mediante sonicación en la punta durante 1 min (1 s encendido y 1 s apagado, 35 % de amplitud). La mezcla resultante se centrifugó a 15 871 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar los desechos y la concentración del sobrenadante se ajustó a 4 mg/mL usando un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime, n.° P0009). Se incubó 1 ml del lisado anterior con biotina-azida fotoescindible 0,1 mM (Confluore, n.° BBBD-14), TCEP 1 mM (Sangon, n.° A600974), ligando TBTA 0,1 mM (Aladdin, n.° T162437) y ligando 1 mM CuSO4 durante 1 h con rotación de abajo hacia arriba a temperatura ambiente. Después de la reacción de clic, la mezcla se agregó a una solución premezclada (MeOH: CHCl3: H2O = 4 mL: 1 mL: 3 mL) en una botella de vidrio de 10 mL. Las muestras se mezclaron y centrifugaron a 4500 × g durante 10 min a temperatura ambiente. La solución de las capas inferior y superior se descartó secuencialmente y, posteriormente, el sedimento se lavó dos veces con 1 ml de metanol y luego se centrifugó a 15 871 xg durante 5 min a 4 °C. Se añadió 1 ml de urea 8 M (Aladdin, #U111902) en bicarbonato de amonio 25 mM (ABC, Aladdin, #A110539) para disolver el sedimento. Las muestras se redujeron con ditiotreitol 10 mM (Sangon, #A100281, en ABC 25 mM) a 55 °C durante 40 min y luego se alquilaron agregando yodoacetamida fresca 15 mM (Sangon, #A600539) en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadieron 5 mM adicionales de ditiotreitol para detener la reacción. Se prepararon aproximadamente 100 μL de perlas de resina de agarosa NeutrAvidin (Thermo, #29202) para cada muestra lavando tres veces con 1 mL de PBS. La solución de proteoma anterior se diluyó con 5 ml de PBS y se incubó con perlas de resina de agarosa NeutrAvidin prelavadas durante 4 ha temperatura ambiente. A continuación, las perlas se lavaron tres veces con 5 ml de PBS que contenían SDS al 0,2 % (Sangon, n.° A600485), tres veces con 5 ml de PBS que contenían urea 1 M y tres veces con 5 ml de ddH2O. A continuación, las perlas se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en 200 μl de ABC 25 mM que contenía urea 1 M, CaCl2 1 mM (Macklin, n.° C805228) y 20 ng/μl de tripsina (Promega, n.° V5280). La digestión con tripsina se realizó a 37 °C con rotación durante la noche. La reacción se detuvo agregando ácido fórmico (Thermo, # A117-50) hasta que el pH alcanzó 2–3. Las perlas se lavaron tres veces con 1 ml de PBS que contenía SDS al 0,2 %, tres veces con 1 ml de PBS que contenía urea 1 M y luego tres veces con 1 ml de agua destilada. Liberación de péptidos modificados por fotoescisión (365 nm) durante 90 min con 200 μl de MeOH al 70 %. Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante. Luego, las perlas se lavaron una vez con 100 μl de MeOH al 70 % y se combinó el sobrenadante. Las muestras se secaron en un concentrador de vacío speedvac y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.

Para la identificación y cuantificación de péptidos modificados con oxígeno singulete, las muestras se volvieron a disolver en ácido fórmico al 0,1 % y se analizaron 1 μg de péptidos con un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipado con una fuente nano-ESI con Tune y Xcalibur proporcionados por el proveedor. 4.3 software. Las muestras se separaron en una columna capilar empaquetada interna de 75 μm × 15 cm con material C18 de 3 μm (ReproSil-pur, n.° r13.b9.) y se conectaron a un sistema UHPLC EASY-nLC 1200 (Thermo). Los péptidos se separaron cromatográficamente mediante un gradiente lineal de 95 min de 8 a 50 % de disolvente B (A = 0,1 % de ácido fórmico en agua, B = 0,1 % de ácido fórmico en 80 % de acetonitrilo) y seguido de un aumento lineal hasta 98 ​​% de B en 6 min a un caudal de 300 nL/min. El Orbitrap Fusion Lumos adquirió datos de manera dependiente de los datos, alternando entre escaneos MS y MS2 de escaneo completo. El voltaje de pulverización se fijó en 2,1 kV y la temperatura del capilar de transferencia de iones fue de 320 °C. Los espectros de MS (350 − 2000 m/z) se recolectaron con una resolución de 120 000, AGC de 4 × 105 y un tiempo de inyección máximo de 150 ms. Los diez precursores de carga múltiple más abundantes de cada escaneo completo fueron fragmentados por HCD con una energía de colisión normalizada del 30 %, ventanas de aislamiento de cuadrupolo de 1,6 m/z y una configuración de resolución de 30 000. Se utilizaron objetivos AGC para espectro de masas en tándem de 5 × 104 y 150 ms de tiempo de inyección máximo. La exclusión dinámica se estableció en 30 s. Los iones no asignados o aquellos con una carga de 1+ y >7+ fueron rechazados por MS/MS.

Los datos sin procesar se procesaron utilizando la plataforma computacional FragPipe basada en MSFragger32. Se utilizó un algoritmo de búsqueda abierta con tolerancia de masa precursora de -150 a 500 Da para determinar el cambio de masa y los aminoácidos correspondientes. Luego se usaron modificaciones en histidina con masa delta +229.0964 y +247.1069 Da en PD (proteome discoveryr 2.5, Thermo) para identificar los péptidos modificados.

Se sembraron células que expresaban genes de fusión miniSOG de forma estable en una placa de 6 cm. Cuando se alcanzó una confluencia de ~80 %, las células se lavaron una vez con HBSS (Gibco, n.° 14025092), seguido de incubación con sondas químicas en HBSS a 37 °C durante 1 h e iluminación con un LED azul de 10 W durante 20 min a temperatura ambiente. Para determinar qué tipo de especie de oxígeno reactivo está involucrada en PDPL, vitamina C 0,5 mM (MCE, n.° HY-B0166), Trolox 5 mM (MCE, n.° HY-101445), D2O (Sigma, n.° 7789-20-0), Se añadieron a las células manitol 100 mM (Energy Chemical, #69-65-8), H2O2 100 μM, NaN3 10 mM como aditivos. Después del enjuague con PBS frío, las células se rasparon, se recogieron en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y se lisaron en 200 μl de PBS con 1 inhibidor de proteasa libre de EDTA usando sonicación en la punta durante 1 min (1 s encendido y 1 s apagado, 35 % de amplitud) . La mezcla resultante se centrifugó a 15 871 xg durante 10 min a 4 °C y la concentración del sobrenadante se ajustó a 1 mg/ml utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA. Aproximadamente 50 μL del lisado anterior se incubaron con rodamina-azida 0,1 mM (Aladdin, n.° T131368), TCEP 1 mM, ligando TBTA 0,1 mM y CuSO4 1 mM durante 1 h con rotación ascendente a temperatura ambiente. Después de la reacción de clic, se realizó la precipitación con acetona agregando 250 μL de acetona preenfriada a la muestra, incubando a -20 °C durante 20 min y centrifugando a 6010 × g durante 10 min a 4 °C. El sedimento se recogió y se hirvió en 50 μL de tampón Laemmli 1x durante 10 min a 95 °C. Luego, las muestras se analizaron en gel largo SDS-PAGE, se visualizaron mediante el sistema de imágenes Bio-rad ChemiDoc MP Touch con el software Image Lab Touch.

La expresión y la purificación de la proteína recombinante miniSOG-6xHis se realizaron como se describió anteriormente18. Brevemente, se transformaron células de Escherichia coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) con pET21a-miniSOG-6xHis y se indujo la expresión de la proteína mediante IPTG 0,5 mM (Sangon, #A600168). Después de la lisis celular, la proteína se purificó mediante perlas de agarosa Ni-NTA (MCE, n.° 70666), se dializó frente a PBS y se almacenó a –80 °C.

Para el ensayo de etiquetado de proximidad basado en anticuerpos in vitro, se mezclaron miniSOG purificado 100 μM, sonda 3 1 mM y 1 μg de anticuerpo monoclonal de ratón anti-his-tag (TransGen, #HT501-01) en PBS con un volumen de reacción total de 50 μL. La mezcla de reacción se irradió con luz LED azul durante 0, 2, 5, 10 y 20 min a temperatura ambiente. La mezcla se incubó con biotina-PEG3-azida 0,1 mM (Aladdin, #B122225), TCEP 1 mM, ligando TBTA 0,1 mM y CuSO4 1 mM en un agitador ascendente a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la reacción de clic, se añadió tampón Laemmli 4x directamente a la mezcla y se hirvió durante 10 min a 95 °C. Las muestras se corrieron en gel SDS-PAGE y se analizaron mediante transferencia Western de estreptavidina-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).

Para el ensayo de etiquetado de proximidad basado en péptidos in vitro, se utilizó un péptido sintético que contiene histidina (LHDALDAK-CONH2) con amidación C-terminal. En este ensayo, se mezclaron miniSOG purificado 100 μM, sonda 3 10 mM y péptido sintético 2 μg/mL en PBS con un volumen de reacción total de 50 μL. La mezcla de reacción se irradió con luz LED azul durante 1 h a temperatura ambiente. Se analizó una muestra de un microlitro mediante un sistema LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight Mass Spectrometer con software de análisis MassLynx Spectrum).

Las células HEK293T que expresan genes de fusión miniSOG de forma estable se sembraron en placas de 10 cm para diferentes líneas de localización de orgánulos (Mito, ER, Nucleus) y en placas de 15 cm para las líneas Parkin-miniSOG y BRD4-miniSOG. Cuando se alcanzó una confluencia de ~90 %, las células se lavaron una vez con HBSS, seguido de incubación con la sonda 3 en HBSS a 37 °C durante 1 h e iluminación con un LED azul de 10 W como se indica a temperatura ambiente. Para el marcaje de proximidad de Parkin, se añadió protonóforo cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona CCCP (Solarbio, #C6700) 10 μM junto con la sonda 3 en HBSS a 37 °C durante 1 h. Los pasos de lisis celular, química clic, reducción y alquilación fueron los mismos que los anteriores, excepto que se introdujeron 2 mg de lisado y se usó biotina-PEG3-azida en lugar de biotina-azida fotoescindible en la reacción clic. Después del enriquecimiento de las perlas, las perlas se lavaron tres veces con 5 ml de PBS que contenían SDS al 0,2 %, tres veces con 5 ml de PBS que contenían urea 1 M y tres veces con 5 ml de PBS. Después de eso, se añadieron 2 µg de tripsina en 300 µL de ABC 25 mM que contenía urea 1 M para la digestión de proteínas durante la noche a 37 °C. La reacción se extinguió agregando ácido fórmico hasta que el pH alcanzó 2-3. Después de la digestión con tripsina en perlas, la solución peptídica se desalinizó usando la columna SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) y se secó en un concentrador de vacío speedvac. Los péptidos se volvieron a disolver en ácido fórmico al 0,1% y se analizaron 500 ng de péptidos con un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipado con una fuente de nano-ESI como se describe anteriormente. Los péptidos se separaron en una precolumna comercial de RP-HPLC (75 μm × 2 cm) (Thermo, #164946) y una columna analítica de RP-HPLC (75 μm × 25 cm) (Thermo, #164941), ambas empaquetadas con 2 Cuentas de C18 de μm con un gradiente lineal que oscila entre el 8 y el 35 % de ACN en 60 min y seguido de un aumento lineal hasta el 98 % de B en 6 min con un caudal de 300 nl/min. Los espectros de MS (350 − 1500 m/z) se recolectaron con una resolución de 60 000, AGC de 4 × 105 y un tiempo de inyección máximo de 50 ms. Los iones seleccionados se fragmentaron secuencialmente en un ciclo de 3 s por HCD con un 30 % de energía de colisión normalizada, ventanas de aislamiento de cuadrupolo de 1,6 m/z y una resolución de 15 000. Se utilizaron objetivos AGC para espectro de masas en tándem de 5 × 104 y 22 ms de tiempo máximo de inyección. La exclusión dinámica se estableció en 45 s. Los iones no asignados o aquellos con una carga de 1+ y >7+ fueron rechazados por MS/MS.

Los pasos de preparación de la muestra hasta el enriquecimiento de las perlas de NeutrAvidin fueron los mismos que en el análisis LC-MS/MS mencionado anteriormente. Se usaron alrededor de 50 µg de lisado como entrada de control de carga y se usaron 2 mg de lisado para la reacción de clic. Después del enriquecimiento y lavado con NeutrAvidin, las proteínas de unión se eluyeron añadiendo 50 µl de tampón Laemmli a las perlas de resina de agarosa y hirviéndolas durante 5 min a 95 °C. La entrada de control de carga y las muestras enriquecidas con perlas se analizaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, n.º ISEQ00010) mediante métodos de transferencia Western estándar. Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5 % (Sangon, nº A600669) en TBS que contenía Tween-20 al 0,1 % (TBST) y se incubaron secuencialmente con anticuerpos primarios y secundarios. El anticuerpo primario se usó a una dilución de 1:1000 en leche descremada al 5 % en TBST y se incubó durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos secundarios se usaron a 1:5000 y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se visualizaron usando quimioluminiscencia mediante el sistema de imágenes Chemidoc MP. Los escaneos sin recortar de todas las transferencias y geles en las figuras se proporcionan como datos de origen.

Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio incluyen anticuerpo monoclonal de conejo anti-SFPQ (CST, n.° 71992), anticuerpo monoclonal de conejo anti-FUS (CST, n.° 67840), anticuerpo policlonal de conejo anti-NSUN2 (Proteintech, n.° 20854-1-AP), anticuerpo policlonal de conejo anti-mSin3A (Abcam, #ab3479), anticuerpo monoclonal de ratón anti-Flag tag (TransGen, #HT201-02), anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-actina (TransGen, #HC201-01), conejo anti-CDK2 anticuerpo monoclonal (ABclonal, #A0094), anticuerpo monoclonal de conejo anti-CTBP1 (ABclonal, #A11600), anticuerpo policlonal de conejo anti-DUT (ABclonal, #A2901), anticuerpo policlonal de conejo anti-PSMC4 (ABclonal, #A2505), anticuerpo anti- Anticuerpo policlonal de conejo DNAJB1 (ABclonal, #A5504). Estos anticuerpos se usaron a una dilución de 1:1000 en leche descremada al 5% en TBST. Los anticuerpos secundarios utilizados en este estudio incluyen IgG anti-conejo (TransGen, #HS101-01), IgG anti-ratón (TransGen, #HS201-01) a una dilución de 1:5000.

Para examinar más a fondo si BRD4 interactúa con SFPQ, HEK293T y BRD4-miniSOG que sobreexpresan células estables HEK293T se sembraron en placas de 10 cm. Las células se lavaron con PBS frío y se lisaron en 1 ml de tampón de lisis Pierce IP (Thermo Fisher, n.º 87787) con inhibidor de proteasa libre de EDTA 1x durante 30 min a 4 °C. A partir de entonces, los lisados ​​se recogieron en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y se centrifugaron a 15 871 xg durante 10 min a 4 °C. Los sobrenadantes se recogieron y se incubaron con 5 µg de anticuerpo monoclonal de ratón anti-etiqueta V5 (CST, n.° 80076) durante la noche a 4 °C. Aproximadamente 50 µL de perlas magnéticas de proteína A/G (MCE, #HY-K0202) se lavaron dos veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,5 %. Posteriormente, el lisado celular se incubó con las perlas magnéticas con rotación de abajo hacia arriba durante 4 h a 4 °C. Luego, las perlas se lavaron cuatro veces con 1 ml de tampón PBST y se hirvieron durante 5 min a 95 °C. Las muestras se corrieron en gel SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF mediante métodos estándar de transferencia Western. Las membranas se bloquearon en leche descremada al 5% en TBST y se incubaron secuencialmente con anticuerpos primarios y secundarios. El anticuerpo monoclonal de conejo anti-SFPQ primario (CST, #71992) se usó a una dilución de 1:1000 en leche descremada al 5 % en TBST y se incubó durante la noche a 4 °C. Se usó IgG anti-conejo a 1:5000 y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se visualizaron usando quimioluminiscencia mediante el sistema de imágenes Chemidoc MP.

Todas las estructuras utilizadas para el análisis del área de superficie accesible por disolvente (SASA) se obtuvieron del banco de datos de proteínas (PDB)52 o de la base de datos de estructuras de proteínas AlphaFold53. El SASA absoluto de cada residuo se calculó mediante el programa FreeSASA54. Solo se usaron los datos SASA de las histidinas marcadas y sus vecinos que estaban completos y sin ambigüedades para obtener el SASA promedio para cada estructura. La Accesibilidad Relativa al Solvente (RSA) para cada histidina se calculó dividiendo los valores absolutos de SASA por el área superficial empírica máxima accesible al solvente del residuo55. Luego, todas las histidinas se clasificaron como enterradas si el RSA promedio era inferior al 20% y expuestas en caso contrario56.

Los archivos sin procesar adquiridos en modo DDA se buscaron en las bases de datos de proteínas revisadas por SwissProt correspondientes que contenían contaminantes comunes utilizando Proteome Discoverer (v2.5) o MSfragger (Fragpipe v15.0). Se requería que los péptidos fueran completamente trípticos con un máximo de dos sitios de escisión perdidos, carbamidometilación como modificación fija y oxidación de metionina como modificación dinámica. La tolerancia de masa del precursor y del fragmento se estableció en 10 ppm y 0,02 Da (MS2 orbitrap), respectivamente. Se eliminaron los impactos de contaminantes y se filtraron las proteínas para obtener una tasa de descubrimiento falso de <1 %. Se utilizaron abundancias de proteínas normalizadas de tres réplicas biológicas para el análisis de cuantificación sin etiquetas. El análisis de localización subcelular de proteínas fue posible gracias al análisis Gene Ontology (GO) de DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 y una base de datos recopilada y publicada por Alice Ting group8. Las parcelas de volcanes se adquirieron de Perseus (v1.6.15.0). Los cambios en la abundancia de proteínas se probaron para determinar la significación estadística utilizando una prueba t de dos caras, y los aciertos de proteínas se identificaron con un cambio de abundancia> 2 (a menos que se indique lo contrario) y un valor de p <0.05. El análisis de interacción de proteínas se realizó utilizando el análisis GO, así como la base de datos String.

Se realizaron tres réplicas biológicas con resultados similares. El análisis estadístico se realizó en GraphPad Prism (GraphPad Software) y los gráficos de volcanes se adquirieron de Perseus (v1.6.15.0). Para la comparación entre dos grupos, los valores de p se determinaron utilizando una prueba t de Student bilateral. Las proteínas singleton que solo se identificaron en grupos experimentales al menos dos veces, se incluyeron en los gráficos de volcanes, y Perseus reemplazó los valores faltantes correspondientes en los grupos de control de la distribución normal para permitir el cálculo del valor p. Las barras de error representan medias ± DE. En el análisis de proteómica, las abundancias de proteínas que aparecen en al menos dos réplicas biológicas se mantuvieron para permitir el análisis estadístico. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos no fueron aleatorios. Los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de espectrometría de masas generados en este estudio se depositaron en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios iProX57 con el identificador de conjunto de datos PXD034811 (conjunto de datos PDPL-MS). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a la instalación central de espectrometría de masas, la instalación central de imágenes y la instalación central de secuenciación en el Laboratorio de la Bahía de Shenzhen por su ayuda en el procesamiento de muestras. Agradecemos al Dr. Yu-Hsan Tsai, al Dr. Xiaoyu Li y al Dr. Jeff Montgomery por su útil debate y asistencia en la revisión. Agradecemos el apoyo financiero de este trabajo de los siguientes: Subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (32101200 a GL), Subvención del Fondo Conjunto Regional de Guangdong-Shenzhen (2020A1515110903 a GL) y Subvención del Fondo Abierto del Laboratorio de la Bahía de Shenzhen ( SZBL2020090501008 a GL).

Estos autores contribuyeron por igual: Yansheng Zhai, Xiaoyan Huang.

Instituto de Sistemas y Biología Física, Laboratorio de la Bahía de Shenzhen, Shenzhen, 518132, China

Yansheng Zhai, Xiaoyan Huang, Keren Zhang, Yuchen Huang, Jingwei Cui, Zhe Zhang, Weiye Zhong y Gang Li

Departamento de Química, UF Scripps Biomedical Research, 130 Scripps Way, Jupiter, FL, 33458, EE. UU.

yanlong jiang

Escuela de Ciencias de la Vida, Universidad de Ciencia y Tecnología de China, Hefei, Anhui, 230026, China

zhe zhang

Núcleo de espectrometría de masas multiómica, Oficina de instalaciones centrales, Laboratorio de la bahía de Shenzhen, Shenzhen, 518132, China

Cookson KC Chiu

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Todos los autores revisaron el manuscrito. GL concibe el estudio y la investigación supervisada. YZ, XH, KZ, YH y GL diseñaron y analizaron experimentos. YZ, XH, KZ, YH, JC, WZ y CKCC realizaron experimentos. YJ propuso el mecanismo químico. ZZ realizó el análisis SASA. YZ y GL escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Gang Li.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Zhai, Y., Huang, X., Zhang, K. et al. Perfiles de redes de proteínas resueltas espaciotemporalmente con etiquetado de proximidad dependiente de fotoactivación. Nat Comun 13, 4906 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32689-z

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Recibido: 23 de marzo de 2022

Aceptado: 11 de agosto de 2022

Publicado: 20 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32689-z

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