La inhibición farmacológica de HDAC6 mejora los fenotipos musculares en la distrofina

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 7108 (2022) Citar este artículo

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La ausencia de distrofina en la distrofia muscular de Duchenne interrumpe el complejo glicoproteico asociado a la distrofina, lo que da como resultado la fragilidad y atrofia de las fibras musculares esqueléticas, asociadas con fibrosis, así como con la desorganización de los microtúbulos y las uniones neuromusculares. Recientemente se demostró que la histona desacetilasa 6 citoplasmática específica y no convencional (HDAC6) regula la distribución del receptor de acetilcolina y la atrofia muscular. Aquí, informamos que la administración del inhibidor selectivo de HDAC6 tubastatina A a la distrofia muscular de Duchenne, el modelo de ratón mdx aumenta la fuerza muscular, mejora los microtúbulos, la unión neuromuscular y la organización del complejo de glicoproteína asociado a la distrofina, y reduce la atrofia muscular y la fibrosis. Curiosamente, encontramos que los efectos beneficiosos de la inhibición de HDAC6 implican la regulación negativa de la señalización del factor de crecimiento transformante beta. Al aumentar la acetilación de Smad3 en el citoplasma, la inhibición de HDAC6 reduce la fosforilación de Smad2/3, la translocación nuclear y la actividad transcripcional. Estos hallazgos proporcionan evidencia in vivo de que Smad3 es un nuevo objetivo de HDAC6 e implican a HDAC6 como un posible objetivo terapéutico en la distrofia muscular de Duchenne.

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es un trastorno neuromuscular recesivo ligado al cromosoma X que afecta aproximadamente a 1 de cada 3500 varones recién nacidos en todo el mundo y es la forma más común y mortal de distrofia muscular1,2. Los pacientes con DMD manifiestan sus primeros síntomas clínicos a los 3 o 4 años de edad y se vuelven dependientes de la silla de ruedas entre los 7 y los 13 años. El período de deambulación se puede prolongar en muchos niños con DMD con el inicio temprano del tratamiento con esteroides. La etapa terminal de la enfermedad comienza cuando los pacientes requieren ventilación asistida a la edad de 20 años y los pacientes suelen fallecer en la tercera o cuarta década por insuficiencia respiratoria o cardíaca3,4,5,6,7. La DMD resulta de mutaciones en el gen de la distrofina que provocan la síntesis de distrofina no funcional o su ausencia total. La distrofina es un componente crítico del complejo glicoproteico asociado a la distrofina (DGC) en el músculo8. El DGC es una estructura que se extiende por el sarcolema y forma un vínculo mecánico entre el citoesqueleto interno y la matriz extracelular a través de la asociación de distrofina con citoesqueletos de actina y microtúbulos y la unión de distroglicano a laminina en la lámina basal, respectivamente9,10. Durante la contracción muscular, el DGC actúa como un amortiguador molecular y estabiliza la membrana plasmática11,12. La pérdida de distrofina se asocia con la pérdida del DGC y se produce el deterioro y la degeneración muscular, lo que impide que el DGC ejerza sus funciones. Esto hace que las fibras musculares sean más susceptibles al daño de la membrana inducido por la contracción que conduce a la muerte celular13,14,15,16. Este proceso patológico se acompaña de inflamación y fibrosis que participan en la atrofia muscular y la pérdida de función17,18,19,20,21.

A pesar de los tremendos esfuerzos de investigación, todavía no hay cura disponible para los pacientes con DMD. Se están investigando activamente estrategias terapéuticas basadas en genes, como la omisión de exón, la supresión de los codones de terminación, la administración de minidistrofina mediada por virus adenoasociados (AAV) o la edición de genes CRISPR/Cas9 para tratar la DMD22,23. Paralelamente, también se están desarrollando tratamientos farmacológicos24,25,26,27. Dichos enfoques actúan sobre vías de señalización específicas y eventos celulares, incluidos aquellos que pueden causar una regulación al alza de la utrofina A28,29,30. No obstante, los glucocorticoides siguen sirviendo como la terapia estándar de oro, actuando principalmente como fármacos antiinflamatorios31. Con el uso de esteroides y la atención multidisciplinaria, particularmente la ventilación mecánica, la expectativa de vida de los pacientes con DMD se ha prolongado considerablemente y las personas afectadas ahora pueden alcanzar los 30 a 40 años de edad.

La señalización de TGF-β juega un papel central en la promoción de la atrofia muscular y la fibrosis en los trastornos neuromusculares. Una variedad de ligandos, incluidos GDF8/miostatina, GDF11 y activinas, se unen a los receptores TGF-β de tipo II y desencadenan la fosforilación de los factores de transcripción Smad2 y Smad3 tras la activación. La fosforilación de Smad2/3 permite la oligomerización con Smad4 y la translocación al núcleo para activar la expresión de genes implicados en la atrofia muscular en cooperación con los factores de transcripción FoxO32,33,34. La inhibición de Smad2 y Smad3 es suficiente para inducir el crecimiento muscular y la expresión constitutiva de Smad3 desencadena la atrofia muscular35,36. Curiosamente, el trabajo anterior ha demostrado que existe diafonía entre la señalización de TGF-β y mTOR. De hecho, la miostatina/GDF8 inhibe la señalización de Akt/mTOR a través de un aumento de la traducción de PTEN inducido por Smad337. En conjunto, parece que la señalización de TGF-β es un objetivo farmacológico atractivo para prevenir la atrofia muscular. Tales terapias basadas en fármacos podrían tener beneficios significativos para las condiciones atróficas, incluidas varias enfermedades neuromusculares, la caquexia y la sarcopenia.

HDAC6 es un miembro citoplasmático único de la familia de las histonas desacetilasas (HDAC), perteneciente a la clase IIb HDAC38,39. HDAC6 desacetila varios sustratos citoplasmáticos como α-tubulina, cortactina y HSP90, mientras que otras HDAC suelen ser reguladores centrales de la expresión génica. De hecho, las HDAC clásicas, como HDAC4 y HDAC5, están involucradas en la regulación de atrogenes a través de los factores de transcripción Myogenin y Foxo340,41. En este contexto, hemos demostrado previamente que HDAC6 es un atrogen activado por FoxO3a que puede interactuar con la ubiquitina ligasa atrogin1/MAFbx42. Se han realizado esfuerzos considerables para desarrollar inhibidores de HDAC6 específicos para tratar una variedad de enfermedades. En particular, se han propuesto varios tratamientos contra el cáncer dirigidos a HDAC643,44. Además, se ha demostrado que la eliminación o inhibición de HDAC6 es beneficiosa para algunos trastornos neurodegenerativos, incluida la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth45,46,47. El inhibidor de HDAC, la tubastatina A (TubA) se destaca como un inhibidor altamente selectivo de HDAC6. De hecho, TubA inhibe de forma eficiente y específica la actividad de la desacetilasa de la HDAC6 con una IC50 de 15 nM y una selectividad estricta para la HDAC6 sobre todas las demás HDAC (más de 1000 veces), excepto para la HDAC8 (57 veces)46,48,49. Se sabe que TubA inhibe la expresión de colágeno tipo 1 inducida por TGF-β en fibroblastos pulmonares50,51 e informes anteriores han demostrado que TGF-β aumenta la actividad de HDAC650,52. De hecho, Smad7 regula la expresión de HDAC6 en el cáncer de próstata en respuesta a TGF-β53 y HDAC6 puede desempeñar un papel indispensable en el equilibrio del mantenimiento y la activación de los folículos primordiales a través de la señalización del objetivo de rapamicina (mTOR) en ratones54,55.

Trabajos previos con inhibidores de pan-HDAC han demostrado que la inhibición de HDAC mejora el fenotipo distrófico27,56. Sin embargo, actualmente no está claro qué HDAC está involucrado en este efecto beneficioso. En un estudio reciente, descubrimos que HDAC6 regula la estabilidad de los microtúbulos y la agrupación de receptores de acetilcolina (AChR) en las fibras musculares normales57. Por lo tanto, nos preguntamos si HDAC6 podría desempeñar un papel en el mecanismo patológico de la DMD y utilizarse como un nuevo objetivo terapéutico para la enfermedad. Para probar esto, investigamos el efecto de TubA, un inhibidor altamente selectivo de HDAC6, en el modelo de ratón DMD mdx y las células C2C12. En conjunto, nuestros resultados muestran que la inhibición farmacológica de la actividad de la HDAC6 desacetilasa con TubA es beneficiosa para el músculo de ratones mdx, tanto funcional como morfológicamente. La investigación mecánica del modo de acción de TubA reveló que la inhibición de HDAC6 regula a la baja la señalización de TGF-β a través de un aumento de la acetilación de Smad3 en el músculo esquelético.

Para evaluar el efecto de la inhibición de la actividad HDAC6 desacetilasa en ratones deficientes en distrofina, ratones mdx de 7 semanas recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de TubA (mdx-TubA) o vehículo (mdx-veh) a una dosis de 25 mg/kg /día como se describió previamente46,58. Los ratones fueron tratados durante 30 días para permitir la comparación con estudios preclínicos previos que utilizaron esta duración de tratamiento en ratones mdx59,60,61. Se usaron ratones de control de tipo salvaje sin tratar (WT-CTL) como controles de referencia (Fig. 1a). Primero se evaluó la eficiencia del tratamiento con TubA midiendo el aumento en la acetilación de tubulina (Fig. 1b). Como se muestra en la Fig. 1c, 1d, el tratamiento con TubA durante 30 días consecutivos provocó, como se esperaba, un gran aumento en la acetilación de α-tubulina en el músculo tibial anterior (TA) de ratones mdx. De acuerdo con los datos publicados57,58, la cuantificación del nivel relativo de tubulina acetilada mostró un aumento de ~36,5 % ± 7,8 % después del tratamiento con el inhibidor selectivo de HDAC6 (P < 0,001 en comparación con ratones mdx-veh). Para confirmar que la inhibición de HDAC6 no afectaba a la acetilación de histonas, se evaluaron mediante Western blot la acetilación de histonas H3 en lisina 9 (ac-H3K9) y los niveles totales de histonas H3 en músculos TA. De acuerdo con el daño muscular en curso en ratones mdx, la acetilación de H3K9 aumentó en los músculos TA de ratones mdx en comparación con los animales WT-CTL (+43,8% ± 14,6%; Figura complementaria 1a, b). El nivel de proteína HDAC6 aumentó en los músculos de los ratones mdx en comparación con los músculos WT-CTL (+97 % ± 18,7 %; Figura complementaria 1c, d). Sin embargo, TubA no aumentó ni la acetilación de H3K9 ni los niveles de HDAC6 en ratones mdx (P > 0,05). Juntos, estos datos indican que la inyección intraperitoneal de TubA inhibe de forma eficaz y específica la actividad de la desacetilasa HDAC6 en el músculo.

un protocolo de tratamiento TubA. Se evaluaron tres grupos de ratones de 7 semanas de edad durante 4 semanas sin tratamiento (grupo A, ratones C57BL/10: WT-CTL), o tratados con inyección diaria durante 30 días consecutivos con DMSO (grupo B, C57BL/10ScSn -ratones Dmdmdx/J; mdx-veh) o con TubA a 25 mg/kg/día (grupo C, ratones C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J; mdx-TubA). b Para evaluar el nivel de acetilación de tubulina (ac-tubK40) en los músculos TA, se realizaron análisis de transferencia Western. Las cuantificaciones de los niveles de proteína acetilada de α-tubulina (c) y α-tubulina (α-tub, d) (n = 4–5 ratones por grupo) se normalizaron respectivamente a α-tubulina y 2,2,2-tricloroetanol (TCE) . e La fuerza de agarre se midió en una cuadrícula que mide la fuerza de agarre máxima de las patas traseras normalizada con el peso corporal (n = 5 ratones por grupo). f La ganancia de fuerza relativa se calculó mediante la diferencia entre la fuerza de agarre medida el último día (día 30) y el día antes de comenzar el tratamiento (día 0) y se midió con una prueba t pareada (n = 5 ratones por grupo). g La fuerza máxima específica se evaluó mediante la mejor puntuación de fuerza de agarre obtenida en cada animal el día 30 (n = 5 ratones por grupo). Para evaluar los niveles de utrofina A (Utr. A) y β-distroglicano (β-DG) en los músculos TA, se realizaron análisis de transferencia Western (h, k) y cuantificación (i, l) (n = 4 ratones por grupo). Se usó TCE como control de carga. Las secciones transversales del músculo EDL se tiñeron con un anticuerpo contra la utrofina A (j, en gris) o contra el β-distroglicano (m, en gris). Barras de escala: 50 μm. n Miotubos C2C12 de 4 días de edad pretratados durante 24 h con diferentes inhibidores de HDAC6 TubA (5 μM) y tubacina (TBC, 5 μM) o con DMSO (CTL). o Transferencias Western representativas que muestran utrofina A. Se utilizó GAPDH como control de carga. p Cuantificación de los niveles de proteína Utrofina A normalizados con GAPDH (n = 3 experimentos independientes cuantificados). (c, d, e, f, g, i, l, p) Bigotes min a max; la línea en el medio de la caja se traza en la mediana. *P < 0,05; **P < 0,01; ns, no significativo, P > 0,05; Prueba U de Mann-Whitney. kDa, peso molecular relativo en kiloDalton.

A continuación, evaluamos el efecto del tratamiento TubA sobre la fuerza muscular en ratones mdx. Los ratones mdx no tratados de siete semanas de edad exhibieron una fuerza de agarre significativamente menor para todas las patas (P <0.01) en comparación con los ratones WT-CTL (Fig. 1e). Después de 30 días de tratamiento con TubA, la fuerza de agarre de los ratones mdx aumentó significativamente en 1,5 veces (P < 0,05 en comparación con los ratones mdx-veh; Fig. 1e), con una ganancia de fuerza sustancial durante 30 días (P < 0,05; Fig. .1f). El tratamiento con TubA restauró casi por completo la fuerza muscular de los ratones mdx a los niveles de WT (P = 0.5476 en comparación con los ratones WT-CTL; Fig. 1e). Curiosamente, la fuerza máxima también aumentó en un 35 % ± 9,0 % en ratones mdx tratados con TubA en comparación con animales mdx-veh, aunque no alcanzó el nivel significativo debido a la variabilidad interindividual (P = 0,062; Fig. 1 g). Para evaluar la fatigabilidad muscular, se realizó una serie de 8 pruebas de agarre sucesivas a intervalos de 15 segundos después de 30 días de tratamiento con TubA. Los ratones mdx tratados con vehículo mostraron una disminución progresiva de la fuerza, lo que indica fatiga. El tratamiento con TubA evitó de manera eficiente esta caída en la fuerza de agarre, con un aumento del 24,5% ± 6,4% en la fuerza de agarre en el tirón de altura en comparación con los ratones mdx tratados con vehículo (P <0,05; Figura complementaria 1e). En conjunto, estos datos indican que la inhibición de la actividad de la desacetilasa HDAC6 en ratones mdx restaura la fuerza muscular y la fatigabilidad a niveles WT.

Debido a su similitud funcional y estructural con la distrofina, la utrofina A puede compensar la falta de distrofina en la DMD24,29,62,63. En las fibras musculares adultas y sanas, la utrofina A se localiza exclusivamente en las uniones miotendinosas y las sinapsis64,65 y ahora está bien establecido que la expresión de utrofina A a lo largo de las fibras musculares puede compensar eficazmente la falta de distrofina24,29,66,67,68. Los ratones Mdx presentan un fenotipo general más leve que los pacientes con DMD69. Esto se explica en parte por la regulación ascendente compensatoria de la expresión de utrofina A del sarcolema24,25,29,62,63,70,71. Los músculos de todos los grupos de animales descritos en la Fig. 1a se analizaron por Western blot e inmunofluorescencia para evaluar los niveles de utrofina A. Como era de esperar, los niveles de utrofina A aumentaron en el sarcolema (P < 0,05, Fig. 1 h) en mdx ratones en comparación con ratones WT-CTL. El tratamiento con TubA aumentó aún más los niveles de utrofina A ~ 2 veces en comparación con los ratones mdx-veh (P <0.05; Fig. 1i). Los experimentos de inmunofluorescencia establecieron además que el tratamiento con TubA de hecho causó un aumento en los niveles de utrofina A del sarcolema en los músculos del ratón mdx, lo que posiblemente confirió un mayor efecto protector sobre la integridad de la fibra muscular (Fig. 1j). Además, evaluamos tanto la cantidad como la localización de β-distroglicano (β-DG), un miembro del DGC, para determinar si el tratamiento con TubA provocó el reensamblaje del DGC a lo largo del sarcolema. Como era de esperar, en ausencia de distrofina, la acumulación de β-DG en la membrana plasmática disminuye considerablemente (Fig. 1k, m). La cuantificación de transferencia Western reveló que TubA aumentó la cantidad de β-DG en ratones mdx en un 43,2 % ± 7,0 % (P < 0,05; Fig. 1 l). Los experimentos de inmunofluorescencia con TubA (Fig. 1 m) indicaron que además del aumento en los niveles de utrofina A, aumentó la acumulación de β-DG en la membrana plasmática, lo que sugiere que el tratamiento con TubA promovió el reensamblaje del complejo DGC.

Para determinar si los efectos de TubA en la expresión de DGC también se observaron en células musculares cultivadas, los miotubos C2C12 se trataron durante 24 horas con 5 µM de uno de los dos inhibidores selectivos de la actividad de desacetilasa de HDAC6: TubA y tubacin72 (TBC; Fig. 1n). Después del tratamiento, se evaluó la expresión de utrofina A en extractos de células completas mediante transferencia Western (Fig. 1o). Ambos inhibidores de HDAC6 indujeron una regulación al alza significativa de los niveles de utrofina A ∼ 1,75 veces (P < 0,05) en las células musculares C2C12 en comparación con las células tratadas con vehículo (Fig. 1p). Juntos, estos datos demuestran que los tratamientos con inhibidores de HDAC6 aumentan los niveles de utrofina A en los miotubos C2C12, de acuerdo con los datos obtenidos in vivo con ratones mdx.

Para determinar si el tratamiento con TubA proporcionó beneficios adicionales a las fibras musculares mdx, se evaluó la atrofia muscular. Estudios histopatológicos previos han demostrado que la distribución anormal del tamaño de las fibras con un fuerte aumento de fibras muy pequeñas es un sello distintivo de los músculos distróficos73. La distribución del tamaño de las fibras se evaluó midiendo el área transversal (CSA) de las fibras individuales en el músculo sóleo oxidativo lento (SOL) y el músculo extensor largo de los dedos (EDL) glucolítico rápido, de ratones mdx tratados con TubA o vehículo y en ratones de control. Como era de esperar, los perfiles de CSA de los músculos mdx tratados con vehículo mostraron una heterogeneidad sustancial y tenían muchas fibras pequeñas en comparación con los músculos sanos (Fig. 2a, b). En todos los músculos analizados, TubA restauró la distribución del tamaño de las fibras a un nivel comparable al de los músculos WT al disminuir significativamente la proporción de fibras musculares pequeñas y reducir la proporción de fibras musculares grandes (Fig. 2c, d). En ratones mdx tratados con TubA, estas adaptaciones musculares fueron acompañadas por una disminución significativa del coeficiente de varianza promedio. De hecho, el tratamiento con TubA redujo en ~ 25% (P <0.01, en comparación con ratones mdx-veh) el coeficiente de variación de las fibras CSA en los músculos mdx EDL y SOL (Fig. 2e, f). En general, 30 días de tratamiento con TubA normalizaron la distribución del tamaño de las fibras en los músculos EDL y SOL mdx, lo que indica un efecto protector de TubA contra la atrofia y la degeneración muscular.

Áreas de sección transversal (CSA) de músculos EDL (a) y SOL (b) completos de ratones C57BL/10 de 11 semanas de edad (WT-CTL) y ratones C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J tratados con vehículo-DMSO (mdx -veh) o con TubA (mdx-TubA) durante 30 días consecutivos se tiñeron con tinción de laminina y luego se binarizaron en ImageJ (n = 5 ratones por grupo). Barras de escala: 500 μm. Resumen gráfico de CSA en músculo EDL (c) y SOL (d) (n = 5 ratones por grupo; se contaron los músculos EDL y SOL completos por ratón). c, d Los datos se presentan como valores medios ± SEM. *P < 0,05; **P < 0,01; ANOVA de dos vías (mdx-TubA frente a mdx-veh). Las CSA medianas de cada músculo se muestran encima de los histogramas de frecuencia. Mediciones del coeficiente de varianza en fibras musculares EDL (e) y SOL (f) (n = 5 ratones por grupo). Para evaluar los niveles de MAFbx (g, h) y MuRF1 (i, j) en los músculos TA, se realizaron análisis de transferencia Western (g, i) y cuantificaciones (h, j) (n = 5 ratones por grupo). k Se tiñeron ejemplos representativos de secciones transversales de músculos EDL y SOL con hematoxilina y eosina. Barras de escala: 100 µm. Las fibras nucleadas centralmente están coloreadas en verde. Porcentaje de nucleación central en fibras musculares EDL (l) y SOL (m) (n = 4 o 5 ratones por grupo). Para evaluar los niveles de colágeno tipo I alfa 1 (n, o, Col1A1) y factor de crecimiento del tejido conectivo (p, q, CTGF) en los músculos TA, se realizaron análisis de Western blot (n, p) y cuantificaciones (o, q) ( n=4 ratones por grupo). Se usó TCE como control de carga para todas las transferencias Western. Para evaluar el nivel de infiltración del contenido de colágeno, se realizó la tinción (r) y la cuantificación (s) del tricrómico de Masson en el músculo SOL. Barras de escala: 500 µm. El área fibrótica está coloreada en azul (n = 28–50 campos contados por ratón, 3 ratones por grupo). (e, f, h, j, l, m, o, q, s) Bigotes min a max; la línea en el medio de la caja se traza en la mediana. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ns, no significativo, P > 0,05; Prueba U de Mann-Whitney. kDa, peso molecular relativo en kiloDalton.

Anteriormente mostramos que HDAC6 contribuye a la atrofia muscular42. Dado el aumento general en el tamaño de la fibra observado en los músculos mdx con el tratamiento con TubA, investigamos el mecanismo por el cual la inhibición farmacológica de HDAC6 disminuyó la atrofia muscular en ratones mdx (Fig. 2 g, i). Para ello, se evaluó mediante Western blot la expresión de marcadores proteicos implicados en la atrofia muscular. TubA provocó una reducción del 57 % ± 11 % de MAFbx/atrogin1 (P < 0,05; Fig. 2h) y una reducción del 35 % ± 4 % de la ubiquitina-proteína ligasa E3 MuRF1/TRIM63 (P < 0,05; Fig. 2j) en comparación con animales mdx-veh. Juntos, estos datos indican que la inhibición de HDAC6 reduce la expresión de mediadores clave de la atrofia muscular, lo que proporciona una explicación para la normalización del tamaño de las fibras musculares.

Además, la heterogeneidad en el tamaño de las fibras mdx resulta principalmente de la presencia de pequeñas fibras en regeneración posteriores a la pérdida de fibras necróticas. La nucleación central es un indicador clave del daño muscular en las fibras musculares distróficas73,74. Para evaluar el efecto de TubA sobre la extensión del daño muscular, se evaluó el número de fibras con núcleos centrales mediante tinción con hematoxilina eosina (Fig. 2k). TubA provocó una disminución significativa en el número de fibras centronucleadas (−15 % ± 2 % en el músculo EDL, Fig. 2 l y −24 % ± 2 % en el músculo SOL, Fig. 2 m; ambas P < 0,05, en comparación con mdx -veh ratones). Además, la pérdida de fibras musculares se acompaña de la acumulación progresiva de tejido fibrótico75. Por lo tanto, investigamos mediante Western blot si TubA redujo la expresión de proteínas asociadas a la fibrosis en los músculos mdx (Fig. 2n, p). Los niveles de proteína de la cadena alfa 1 de colágeno tipo I (Col1A1) y el factor de crecimiento del tejido conjuntivo (CTGF) se redujeron en ratones mdx tratados con TubA en comparación con los ratones mdx tratados con vehículo (-36% ± 7%, Fig. 2o y -16). % ± 1%, Fig. 2q, respectivamente, P < 0,05). Para confirmar estos resultados, se realizó la tinción tricrómica de Masson en criosecciones de músculos SOL (Fig. 2r) y EDL (Fig. 2a complementaria). TubA disminuyó significativamente el área fibrótica en el músculo mdx SOL (P < 0,001; Fig. 2s) en comparación con el control mdx SOL (tratado con vehículo). En el músculo EDL, el efecto de TubA en la superficie positiva de colágeno general no alcanzó significación (P> 0.05; Figura complementaria 2b). Sin embargo, TubA evitó de manera eficiente la formación de áreas con alto contenido de colágeno en el músculo EDL mdx. En conjunto, estos datos muestran que la inhibición de HDAC6 en el músculo distrófico reduce la nucleación central, normaliza la distribución del tamaño de las fibras, disminuye la proporción de fibras pequeñas y previene la fibrosis.

La distrofina y la utrofina A vinculan el complejo DGC a la red de microtúbulos10,76. De acuerdo con datos previos10,77, confirmamos mediante transferencia de Western y tinción de inmunofluorescencia que las fibras musculares TA y EDL de ratón mdx tienen más tubulina y una mayor densidad de microtúbulos, respectivamente, que los ratones WT-CTL (P <0.05, Fig. 1d y Suplementario Fig. Fig. 3a, b). Sin embargo, el tratamiento con TubA no afectó la abundancia general de α-tubulina (P> 0.05 en comparación con ratones mdx-veh; Fig. 1d). En el músculo sano, la red de microtúbulos forma una rejilla con microtúbulos longitudinales, transversales y perinucleares78,79,80. Aquí, en ratones WT-CTL, observamos que los microtúbulos transversales y longitudinales están espaciados regularmente por ~ 2 µm y ~ 5 µm, respectivamente (ver las puntas de flecha en la Fig. 3a y la Fig. 3c-e complementaria). En los músculos mdx, los experimentos de inmunofluorescencia muestran una desorganización de la red de microtúbulos, con una pérdida de la organización en forma de rejilla (véanse las flechas en la Fig. 3a). Curiosamente, en los ratones mdx tratados con TubA, se restauró la red de microtúbulos (consulte el espacio entre los microtúbulos en los escaneos de líneas azul y amarilla y la figura complementaria 3c-e). Analizamos más a fondo la red de microtúbulos con un software desarrollado específicamente para analizar la direccionalidad de los microtúbulos81 (programa TeDT; Fig. 3b). El análisis del programa TeDT reveló una disminución significativa de los microtúbulos orientados transversalmente (centrados alrededor de 90 °) en los músculos mdx tratados con vehículo en comparación con los ratones WT y mdx tratados con TubA (P <0.05 en comparación con los ratones mdx-veh). Estos datos muestran que el tratamiento con TubA mejora la organización de la red de microtúbulos en los músculos mdx. De acuerdo con trabajos previos57,82, esto demuestra además que la acetilación de microtúbulos a través de la inhibición de HDAC6 estabiliza los microtúbulos y favorece su orientación transversal.

a, c Fibras aisladas de TA de ratones C57BL/10 de 11 semanas de edad (WT-CTL) y ratones C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J tratados con vehículo-DMSO (mdx-veh) o con TubA (mdx-TubA) para 30 días consecutivos se tiñeron con un anticuerpo contra la β-tubulina (ß-tub) para marcar la red de MT (a, en rojo) o con α-bungarotoxina-A488 (c, en verde, α-BTX–A488) para marcar las NMJ . Barras de escala: 25 μm. b Análisis de organización de la red MT utilizando el software TeDT (n = 4 a 6 fibras de 3 ratones). El gráfico final generado presenta una puntuación global para cada grado dado de orientación de MT, con 0 y 180 grados correspondientes a la MT longitudinal y 90 grados correspondientes a la MT transversal; histogramas direccionales (HD). Las puntas de flecha representan la organización regular de la red MT, mientras que las flechas muestran la desorganización de la red MT, con una pérdida de la organización en forma de cuadrícula. Se realizó un resumen gráfico del diámetro de la placa terminal de NMJ (d) y la compacidad de NMJ (e). Comparación d, e, *, ** y *** entre ratones mdx-veh frente a mdx-TubA. La mediana de cada grupo de ratones se muestra encima de los histogramas de frecuencia (n = 40–75 NMJ contados). Se ha cuantificado la distribución del número de fragmentos (f) y el índice de fragmentación (g) (n = 43-73 de NMJ contadas). g Bigotes min a max; la línea en el medio de la caja se traza en la mediana. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; (mdx-TubA versus mdx-veh), prueba U de Mann-Whitney.

La distribución altamente fragmentada del receptor de acetilcolina postsináptico (AChR) observado en los músculos mdx sugiere fuertemente que la distrofina participa en el mantenimiento del NMJ83. Dado que la inhibición de HDAC6 aumenta la compacidad de la distribución de AChR en el NMJ57, analizamos la organización de NMJ en ratones mdx de control y tratados (Fig. 3c). La tinción con bungarotoxina α, utilizada para visualizar el receptor de acetilcolina, indicó que la organización de la NMJ estaba gravemente comprometida en los ratones tratados con mdx-veh de control en comparación con los NMJ WT de control (Fig. 3c, d), como se esperaba de trabajos anteriores84,85,86. Más específicamente y en comparación con los músculos WT, la compacidad de las NMJ mdx-veh disminuyó en un 26 % ± 11 % (P < 0,05; Fig. 3e), la superficie general de las NMJ aumentó en un 38 % ± 18 % (P < 0,05 ; Fig. 3d), el índice de fragmentación se incrementó aproximadamente al doble (P < 0,001; Fig. 3g) y se incrementó el número promedio de fragmentos por NMJ (P < 0,001; Fig. 3f). El tratamiento TubA restauró casi a la normalidad la superficie NMJ (−24 % ± 13 %, P < 0,05 en comparación con las NMJ mdx tratadas con vehículo; Fig. 3d) y la compacidad (+31,3 % ± 12,5 %, P < 0,05 en comparación con las NMJ mdx tratadas con vehículo Fig. 3e y Fig. complementaria 3f, g). En comparación con los ratones mdx tratados con vehículo, TubA también normalizó parcialmente el índice de fragmentación −13,2 % ± 2 % (P < 0,05; Fig. 3g) y el número de fragmentos por NMJ (+63 % ± 1 % de NMJ compuestos de 1 a 3 fragmentos, P < 0,05; Fig. 3f). En conjunto, el tratamiento con TubA restauró parcialmente la distribución normal de AChR en las fibras musculares de ratones mdx a través de un aumento en la compacidad y el reclutamiento de parches de AChR.

Se sabe que la transcripción de distrofina también se controla a través de la vía mTOR87. De hecho, la deficiencia de mTOR conduce a un contenido reducido de distrofina muscular y causa defectos distróficos que conducen a una miopatía grave. En este contexto, investigamos si la inhibición de HDAC6 en el músculo mdx podría promover la síntesis de proteínas al medir la fosforilación de varios componentes de la vía mTOR (Fig. 4a). El nivel de proteína mTOR no cambió significativamente con el tratamiento con TubA (P = 0,342; Fig. 4b, c), mientras que se observó un aumento de ∼2 veces en la fosforilación de la quinasa p70-S6 en la treonina 389 (P < 0,05; Fig. 4d, e) . De acuerdo con el aumento de la actividad de la quinasa p70-S6, observamos un aumento de ~2 veces de la fosforilación de S6 tanto en Ser235-236 como en Ser240-244 (P <0.05; Fig. 4f, g, h). Finalmente, TubA indujo un aumento significativo en la fosforilación del inhibidor de la traducción 4E-BP1 en los sitios sensibles a mTOR, como lo demuestra el aumento en la proporción de isoformas 4E-BP1 γ sobre 4E-BP1 β para fosfo-Thr37-46, fosfo -Thr70 así como para el total 4E-BP1 (Fig. 4i, j, k, l). En conjunto, nuestros datos muestran que un tratamiento de 30 días con TubA estimula la síntesis de proteínas musculares en ratones mdx a través de la vía mTOR.

un resumen esquemático de los objetivos posteriores de mTOR. Se analizaron ratones C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J de 11 semanas de edad tratados con TubA (mdx-TubA) o con vehículo-DMSO (mdx-veh) durante 30 días consecutivos en músculo TA mediante análisis de transferencia Western (b, d, f, i). Cuantificaciones de mTOR (c), pp70 S6 quinasa (e, T389), pS6 (g, S240/244), pS6 (h, S235/236), p4E-BP1 (j, T37/46), p4E-BP1 (k , T70) y 4E-BP1 (l) (n = 4 ratones por grupo). Se usó TCE como control de carga. (c, e, g, h, j, k, l) Bigotes min a max; la línea en el medio de la caja se traza en la mediana. *P < 0,05; ns, no significativo, P > 0,05; Prueba U de Mann-Whitney. kDa, peso molecular relativo en kiloDalton.

Para determinar si el efecto de TubA en la vía mTOR también se observó en células musculares cultivadas, los miotubos C2C12 se pretrataron durante 24 horas con TubA y luego se trataron con rapamicina, un inhibidor selectivo del complejo mTOR 1 (mTORC1) (Fig. 4a). Después del tratamiento, se evaluó la fosforilación de la proteína S6 en extractos de células completas mediante transferencia Western (Fig. 4b complementaria). Como se esperaba, según los datos in vivo, el tratamiento con TubA aumentó la fosforilación de S6 en las células musculares C2C12, en comparación con las células tratadas con vehículo (Fig. 4c, d complementarias). En presencia de rapamicina, la fosforilación de S6 se redujo drásticamente, tanto en presencia como en ausencia de TubA (P <0,001; Figura complementaria 4c, d). Por lo tanto, la inhibición de HDAC6 actúa aguas arriba del complejo mTOR para activar la vía. En estos experimentos, también evaluamos si el aumento en la expresión de utrofina A por el tratamiento con TubA dependía de la vía mTOR. La expresión de utrofina A se evaluó en presencia de TubA con o sin rapamicina. La rapamicina evitó la regulación positiva de la utrofina A por parte de TubA, lo que indica que el aumento de la utrofina A inducido por TubA involucra la vía mTOR (Figura 4f complementaria). Tanto la señalización de mTOR como la de TGF-β son actores clave en la regulación de la masa muscular y estas vías están interconectadas37,88.

Los efectos de TubA en la vía mTOR, la atrofia muscular y la fibrosis nos llevaron a explorar si la inhibición de HDAC6 afectaba la señalización de TGF-β. La atrofia muscular inducida por la miostatina miembro del TGF-β implica la señalización de Smad2/3 que activa la expresión de MAFbx y regula a la baja la señalización de mTOR89,90. Las proteínas Smad2/3 requieren fosforilación para ingresar al interior del núcleo y activar sus genes diana91. Curiosamente, también se ha demostrado que las proteínas Smad2/3 están acetiladas en el núcleo92,93. Se trataron mioblastos C2C12 de ratón durante 24 horas con vehículo (DMSO), TubA o SB431542 (SB43), un inhibidor específico de la vía TGF-β/Activin/NODAL94. Después de eliminar los inhibidores, los mioblastos C2C12 se expusieron durante 30 min a TGF-β195 humano recombinante (rhTGF-β1) y se analizó la localización subcelular de Smad2/3 mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpos anti-tubulina acetilada y anti-Smad2/3.

El tratamiento con TubA aumentó de manera similar la acetilación de tubulina tanto en presencia como en ausencia de rhTGF-β1, lo que indica que la señalización de TGF-β no afecta la actividad de desacetilasa de HDAC6 (Fig. 5a y Fig. 3a, c complementarias). Como se esperaba96,97, el tratamiento con rhTGF-β1 aumentó la fosforilación de Smad2/3 en las serinas 465-467 y 423-425, respectivamente (Fig. 3b complementaria). De manera consistente, los experimentos de inmunofluorescencia y transferencia Western en células C2C12, respectivamente, indicaron que rhTGF-β1 aumentó la fosforilación y la acumulación nuclear de Smad2/3 que fueron bloqueadas por SB43 (Fig. 5a, b y Fig. 5a-d complementaria). En presencia de TubA, la fosforilación de Smad2/3 y la acumulación nuclear disminuyeron considerablemente (Figs. 5a-d, f-h y Fig. 5a-d complementaria), y esta reducción se correlacionó con un aumento en la acetilación de Smad3 (P < 0,05, figura 5e). Para confirmar estos resultados, se realizó el fraccionamiento celular en presencia o ausencia de TubA para separar una fracción citosólica (CE) y una fracción nuclear, subdividiéndose esta última en un extracto nuclear (NE) y un extracto de cromatina (Chrm) . En presencia de TubA, se invirtió la proporción citoplasmática de fosfoSmad3 nuclear a fosfoSmad3 citoplasmático, lo que confirma que la inhibición de HDAC6 redujo la translocación nuclear de Smad3 (Fig. 5f, g).

a–e Mioblastos C2C12 de 4 días de edad pretratados durante 24 h con inhibidor de HDAC6 (TubA, 5 μM) o inhibidor selectivo de TGF-β1 (SB43, 5 μM) o con DMSO (CTL). A continuación, los mioblastos se trataron durante 30 min con TGF-β1 humano recombinante (rhTGF-β1; 10 ng/ml). a Los mioblastos se tiñeron dos veces con anticuerpos contra Smad2/3 (en verde) y tubulina acetilada (ac-tub, en rojo). Los núcleos se marcaron con DAPI (en azul). Barras de escala: 50 µm. b Resumen gráfico de la distribución nuclear de la intensidad de fluorescencia Smad2/3 de 3 experimentos independientes; ANOVA de dos vías (TubA+rhTGF-β1 frente a DMSO + rhTGF-β1). c Los niveles de fosforilación de Smad2/3 (pSmad), acetilación de Smad2/3 (ac-Smad), Smad2/3, α-tubulina acetilada (ac-tub) y α-tubulina (α-tub) se visualizaron mediante análisis de transferencia Western . Para evaluar los niveles de fosforilaciones de Smad2/3 (d) y acetilación de Smad3 (e) en células C2C12, se han realizado cuantificaciones (n = 5 experimentos independientes cuantificados); Prueba U de Mann-Whitney. f, g Se realizó el fraccionamiento celular en 3 fracciones: fracción citosólica (CE), extracto nuclear (NE) y extracto de cromatina (Chrm). f Los niveles de fosforilación de Smad3 (S423-425), Smad2/3, α-tubulina acetilada (ac-tub-K40), GAPDH, HIRA e histona H3 (H3) se visualizaron mediante transferencia Western de 3 experimentos independientes. g Cuantificaciones de distribución de fosforilación de Smad3 (S423-425); ANOVA de dos vías. Las inmunoprecipitaciones de cromatina (ChIP) se realizaron utilizando anticuerpos contra Smad2/3. Se usaron amplificaciones de qPCR de regiones promotoras inmunoprecipitadas del gen MAFbx (h) o MuRF1 (i) para detectar la presencia de estos fragmentos de ADN en inmunoprecipitados (h, i, n = 3 experimentos independientes); Prueba U de Mann-Whitney. *, P < 0,05. (j, k, l, m, n) Se analizaron ratones C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J de 11 semanas de edad tratados con vehículo-DMSO (mdx-veh) o con TubA (mdx-TubA) durante 30 días consecutivos en Músculo TA por análisis de Western blot (j) y cuantificado (k, l, m, n). Para evaluar los niveles de acetilación de Smad3 (k), acetilación de Smad2 (l), fosforilación de Smad3 (m) y Smad2/3 (n) en los músculos TA, se han realizado cuantificaciones (n = 4 ratones por grupo); Prueba U de Mann-Whitney. Se usó TCE como control de carga para todas las transferencias Western. (d, e, k, l, m, n) Bigotes min a max; la línea en el medio de la caja se traza en la mediana. (b, g, h, i) Los datos se presentan como valores medios ± SEM. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ns, no significativo, P > 0,05. kDa, peso molecular relativo en kiloDalton.

Para investigar el impacto funcional de esta redistribución celular y determinar si TubA afecta la activación de los genes diana Smad2/3, se realizó un ensayo Smad2/3 ChIP en células C2C12 tratadas con rhTGF-β1 o rhTGF-β1 más TubA. Los sitios de unión putativos de Smad se identificaron mediante análisis de software aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción en los promotores de MAFbx y MuRF1, es decir, entre las posiciones -618 y -424 y las posiciones -319 y -205 para MAFbx, y entre las posiciones -727 y -608 para MURF1. Las regiones promotoras de −1978 a −1805 y −1320 a −1232 se usaron como controles negativos para MAFbx y MURF1, respectivamente. La presencia de TubA redujo significativamente la unión de Smad2/3 a los promotores de MAFbx (−63 % ± 12 % y −34 % ± 4 %) y MURF1 (−38 % ± 7 %) en sus regiones de unión previstas (P < 0.05; Fig. 5h, i), que complementa muy bien los datos de fraccionamiento celular.

Se sabe que la señalización de TGF-β está regulada al alza en los músculos distróficos98. Para confirmar in vivo que la inhibición de HDAC6 reducía la señalización de TGF-β, se evaluaron la acetilación y la fosforilación de Smad2/3 mediante transferencia Western en músculos TA de ratones mdx tratados con vehículo-DMSO o TubA (Fig. 5j). En ratones mdx tratados con TubA, la acetilación de Smad3 en Lys19 fue casi tres veces mayor que en ratones mdx tratados con DMSO (P < 0,05; Fig. 5k), mientras que la acetilación de Smad2 no se vio afectada (P > 0,05; Fig. 5l). Este aumento en la acetilación de Smad3 fue paralelo a una disminución del 55% ± 4% de la fosforilación de Smad3 en Ser432-425 (P <0,05; Fig. 5m). En ratones mdx, el tratamiento con TubA tuvo una tendencia a aumentar el nivel total de Smad2/3 en comparación con el animal mdx-veh. Sin embargo, este aumento no fue estadísticamente significativo (P = 0,0571; Fig. 5n). También se evaluó el efecto de TubA en los niveles de Smad4 y Smad7, y no se observaron diferencias con los controles (Fig. 5e-h complementaria).

Los mecanismos que vinculan las vías mTOR y TGF-β/Smad aún no se conocen bien. Sin embargo, se demostró previamente que Smad3 activa la traducción de los ARNm de PTEN, lo que inhibe la señalización de Akt/mTOR y la síntesis de proteínas39 (Fig. 5i complementaria). Por lo tanto, investigamos una posible regulación negativa de la expresión de PTEN consecutiva a la inhibición de Smad 3 por TubA. Tanto en los músculos de ratones mdx como en las células C2C12, TubA indujo una disminución en los niveles de proteína PTEN (P <0.05; Figura complementaria 5j-m). También se examinaron los niveles de proteína Akt y la fosforilación y, de acuerdo con la disminución en los niveles de PTEN, los niveles de proteína Akt1 y Akt2 y la fosforilación aumentaron en presencia de TubA (P <0.05; Figura complementaria 5n-s). En conjunto, esto indicó que lo más probable es que TubA active la vía mTOR a través de Smad3 y PTEN.

Aquí, hemos evaluado el efecto de la inhibición de HDAC6 por TubA en ratones mdx y en células musculares C2C12. El tratamiento con TubA mejoró significativamente la función muscular mdx y disminuyó las características distróficas histopatológicas generales. En busca del mecanismo de acción de HDAC6, descubrimos que HDAC6 regula la señalización de TGF-β a través de la acetilación de Smad3, identificando así a Smad3 como un nuevo objetivo de HDAC6. TubA aumentó la acetilación de Smad3, impidiendo la fosforilación de Smad2/3 y la translocación nuclear, disminuyendo así la expresión de atrogenes como MAFbx y MuRF1 y regulando al alza la vía mTOR. En conjunto, este mecanismo puede explicar el efecto beneficioso de la inhibición de HDAC6 para contrarrestar la atrofia muscular y la fibrosis en los músculos mdx (Fig. 6).

El inhibidor de HDAC6 como TubA induce una disminución en la actividad de HDAC6 que conduce a una acetilación de α-tubulina y de Smad3. La inhibición farmacológica de HDAC6 permite un aumento de la acetilación de α-tubulina para restaurar DGC y estabilizar la organización de la red MT/NMJ. Además, la inhibición específica de HDAC6 aumenta la acetilación de Smad3 que puede interferir con la señalización de TGF-β tanto para reducir la atrofia muscular al reducir la expresión de actores clave como MAFbx/MuRF1 como para estimular la síntesis de proteínas a través de la vía mTOR. Nuestros resultados identifican HDAC6 como un objetivo farmacológico de interés para DMD.

HDAC6 se expresa ampliamente en los tejidos del cuerpo38. En el cáncer, HDAC6 se sobreexpresa y se sabe que se correlaciona con un mal pronóstico99,100. Aquí, observamos que la expresión de HDAC6 aumenta en ratones mdx, lo que indica que podría participar en la patología DMD. De acuerdo con esta noción, la inhibición selectiva de HDAC6 con TubA disminuyó múltiples características patológicas del músculo de ratón mdx, sin afectar los niveles de expresión de HDAC6. Esto sugiere que el efecto beneficioso de la inhibición de HDAC6 reside en la reducción de su actividad desacetilasa, independientemente de su nivel de proteína.

Nuestros resultados indican que la estabilización de los microtúbulos al prevenir su desacetilación preserva la organización de los microtúbulos en los músculos con deficiencia de distrofina. En los músculos mdx, la pérdida de producción de fuerza se atribuye comúnmente a alteraciones estructurales del citoesqueleto de la fibra muscular y cambios en la señalización101. Curiosamente, se demostró que la estabilización de la red de microtúbulos protege contra las lesiones inducidas por contracción, lo que sugiere que dirigirse al citoesqueleto de microtúbulos puede brindar nuevas oportunidades para la intervención terapéutica en DMD77. En consecuencia, los músculos mdx tratados con TubA contienen menos fibras centronucleadas, posiblemente porque las fibras musculares son más resistentes.

Nuestros datos muestran que TubA restaura parcialmente la morfología NMJ en ratones mdx. En pacientes con DMD y ratones mdx, las NMJ están notablemente desorganizadas y muestran déficits en la función/transmisión neuromuscular, lo que destaca la contribución del deterioro de la NMJ en la función alterada y la recuperación de los músculos distróficos83,102,103,104. Recientemente mostramos que HDAC6 está involucrado en la organización de microtúbulos en la NMJ, al regular la distribución de AChR y la organización de la NMJ57. En ratones mdx, los cambios estructurales en los microtúbulos en la NMJ probablemente estén involucrados en la desorganización de la NMJ85. Nuestro presente estudio indica que la protección de la estructura de la UNM mediante la estabilización de los microtúbulos probablemente participa en el efecto beneficioso del tratamiento con TubA sobre la función muscular mdx. En los músculos mdx, los NMJ son anormalmente grandes debido a la fragmentación y nuestros resultados actuales indican que la estabilización de la red de microtúbulos limita esta fragmentación, lo que es consistente con nuestros resultados anteriores que mostraron que el aumento de la acetilación de los microtúbulos restringe la propagación del NMJ58. El aumento de los niveles de utrofina A también podría participar en la mejora de la organización de la NMJ por parte de TubA.

Un aumento significativo de los niveles de utrofina A se correlaciona con un mejor pronóstico en pacientes con DMD105. Por lo tanto, la capacidad de la inhibición de HDAC6 para aumentar los niveles de utrofina A extrasináptica probablemente participa en la preservación de la integridad del músculo mdx. Aún no se ha determinado cómo HDAC6 regula la utrofina A, hemos observado aquí que la rapamicina previene el aumento de la expresión de utrofina A por parte de TubA, lo que indica la participación de la vía mTOR. Una acción beneficiosa adicional de TubA también podría estar mediada por la restauración de la red de microtúbulos que, a su vez, podría mejorar el tráfico de utrofina A hacia la membrana.

A diferencia de la mayoría de las HDAC que actúan directamente sobre la expresión génica a través de complejos reguladores de la transcripción, la HDAC6 es estrictamente citoplasmática y ninguno de sus sustratos conocidos son factores de transcripción. Aquí, mostramos que HDAC6 desacetila Smad3 y regula su acumulación nuclear. Las proteínas Smad2/3 median la acción de la señalización de TGF-β para promover el catabolismo proteico y la fibrosis e inhibir el anabolismo proteico. Por lo tanto, la inhibición de la acumulación nuclear de Smad2/3 por la inhibición de HDAC6 puede explicar el efecto beneficioso de TubA sobre la fibrosis renal106, la reducción de la atrofia muscular y la estimulación de la síntesis de proteínas a través de la vía mTOR. Los efectos beneficiosos de los inhibidores de HDAC, como Givinostat, se demostraron previamente en ratones mdx y pacientes con DMD para estimular la expresión de la proteína de unión a activina folistatina, cuya actividad principal es bloquear la señalización de TGF-β27,56,107. Estos efectos beneficiosos de HDAC6 en los músculos mdx recapitulan los efectos de Givinostat. Además, en músculos de pacientes con mdx y DMD, la inhibición de la actividad de TGF-β atenúa tanto la degeneración como la fibrocalcificación108 y la fibrosis27. Consistentemente, la inhibición de HDAC6 también redujo la fibrosis en los músculos mdx.

En un intento por vincular el efecto de TubA en la señalización de TGF-β con mTOR, observamos que TubA disminuía la expresión de PTEN, lo que apunta al papel conocido de Smad3 en la activación de la traducción de PTEN37. Se sabe que los niveles de PTEN están elevados en los músculos distróficos de pacientes con DMD y ratones mdx, y se demostró que la inhibición de PTEN mejora la función y la regeneración muscular en ratones mdx109. Por lo tanto, el efecto de TubA en la expresión de PTEN probablemente participe en la mejora de los músculos mdx.

Curiosamente, en lugar de afectar directamente la expresión de genes individuales como se muestra para otras HDAC, HDAC6 actúa sobre la señalización de TGF-β al dirigirse a Smad3 en el citoplasma. Por lo tanto, HDAC6 regula los objetivos aguas abajo de Smad2/3, proporcionando así una nueva entrada farmacológica para interferir con la señalización de TGF-β. Smad2 y Smad3 comparten una identidad de secuencia del 92 %, pero sus funciones no son completamente redundantes. Los ratones knock-out para Smad2 mueren en el día embrionario 10,5 con anomalías vasculares y craneales y un patrón de izquierda a derecha alterado110,111, mientras que los ratones knock-out para Smad3 son viables pero sufren una función inmunitaria alterada e inflamación crónica112,113. Además, exhiben preferencias por la asociación con factores de transcripción específicos. Por ejemplo, Smad3 interactúa preferentemente con FoxO sobre Smad232. Curiosamente, los informes anteriores sobre la acetilación de Smad2/3 involucraron exclusivamente factores nucleares92,93 y el efecto de la acetilación de Smad2/3 se correlacionó con la unión del promotor, la actividad de transactivación, la exportación nuclear o la estabilidad de la proteína. En el núcleo, Smad3 es acetilado en la lisina 19 por p300/CBP en respuesta a TGF-β, lo que aumenta su actividad de unión al ADN y su unión a los promotores de genes diana114. La acetilación de Smad3 puede aumentar o disminuir selectivamente la expresión de genes regulados por TGF-β. Cabe destacar que Smad3 también se puede acetilar en varias otras lisinas92,93. Siendo HDAC6 estrictamente citoplasmático, la desacetilación de Smad3 por HDAC6 probablemente afecta a diferentes procesos. Nuestros resultados indican que el aumento de la acetilación de Smad3 reduce la fosforilación de Smad 3 y su acumulación nuclear. Por lo tanto, podemos especular que la prevención de la desacetilación de Smad3 en el citoplasma reduce su fosforilación por los receptores de TGF-β y/o reduce su asociación con Smad4. En conjunto, se requiere la acetilación de Smad3 en el núcleo para activar la expresión de sus genes diana, mientras que la acetilación de Smad3 en el citoplasma inhibe su función. Curiosamente, a pesar del alto nivel de similitud entre Smad2 y Smad3, la inhibición de HDAC6 aumentó selectivamente la acetilación de Smad3, pero afectó la fosforilación y la entrada nuclear tanto de Smad2 como de Smad3. Presumimos que Smad3 acetilado en el citoplasma podría unirse a Smad2 e inhibir su fosforilación, y que la formación de un dímero Smad2/3 acetilado podría reducir su capacidad para ingresar al núcleo. Es concebible que después de su activación por p300, las moléculas Smad2/3 acetiladas que se exportan de regreso desde el núcleo al citoplasma requieran desacetilación por HDAC6 para permitir su reingreso en la vía TGF-β. Por lo tanto, la inhibición de HDAC6 evitaría la desacetilación de Smad3 en el citoplasma, reduciendo así la cantidad de Smad2/3 disponible para participar en la señalización de TGF-β y aumentando la cantidad de Smad2/3 citoplasmático. Otra posibilidad sería que la desacetilación de Smad3 por parte de HDAC6 regule su ubiquitinación y posterior degradación. Ambas hipótesis son consistentes con el hecho de que la inhibición de HDAC6 aumenta la cantidad de proteína citoplasmática Smad2/3.

Anteriormente se informaron conexiones funcionales entre HDAC6 y TGF-β. De hecho, se demostró que la fosforilación de Smad3 y la acumulación nuclear están reguladas por HDAC6106,115. También se demostró que TGF-β induce la desacetilación de α-tubulina por HDAC6, lo que aumenta la motilidad celular115, y la estabilidad de los microtúbulos regula la fosforilación de Smad inducida por TGF-β116,117,118. Al mostrar aquí que HDAC6 regula tanto Smad3 como la acetilación de microtúbulos, nuestros resultados proporcionan un vínculo molecular directo entre la estabilidad de los microtúbulos y la señalización de TGF-β.

En un trabajo anterior, demostramos que la expresión de HDAC6 aumentaba durante la atrofia muscular y que participaba en el desgaste muscular a través de una interacción directa con la ubiquitina ligasa MAFbx42. Por lo tanto, proponemos que la inhibición de HDAC6 previene la degradación de proteínas musculares a dos niveles: inhibición de la señalización de TGF-β a través de Smad2/3 e inhibición de la ubiquitinación y posterior degradación de sustratos MAFbx. La inhibición de la señalización de TGF-β también demostró ser beneficiosa para limitar la caquexia y la progresión del cáncer en modelos de ratón119,120. Muchos tumores secretan TGF-β y el hallazgo de que HDAC6 regula TGF-β también podría ser relevante para explicar los efectos beneficiosos observados sobre la progresión del cáncer con los inhibidores de HDAC653,54,121.

En resumen, nuestros resultados muestran que la inhibición farmacológica de HDAC6 mejora significativamente varios marcadores funcionales, bioquímicos y morfológicos en los músculos esqueléticos de ratones con deficiencia de distrofina a través de tres mecanismos complementarios (Fig. 6): (i) estabilización de microtúbulos que favorece la restauración de NMJ y DGC, (ii) aumento en los niveles de utrofina A, (iii) inhibición de la señalización de TGF-β a través de la orientación de Smad3 que reduce la atrofia muscular, la fibrosis y estimula la síntesis de proteínas. En consecuencia, la inhibición de HDAC6 con agentes farmacológicos representa un objetivo terapéutico atractivo para la DMD que ofrece muchas ventajas, incluida la facilidad de administración, el impacto en todos los músculos y los beneficios para todos los pacientes, independientemente de las mutaciones de distrofina.

Todos los procedimientos que utilizaron animales fueron aprobados por el comité de ética institucional y siguieron las pautas de la Guía del Consejo Nacional de Investigación para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Ottawa. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las Directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Para los experimentos in vivo, se utilizaron tanto el control macho C57 black 10 (C57BL10) como el macho C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J mdx (Laboratorio Jackson Bar Harbor, EE. UU.). Todos los animales se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. Estos ratones se alojaron en un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad a temperatura controlada (23 °C ± 0,9 °C) con 50% ± 4% de humedad, instalaciones con libre acceso a alimentos y agua. Los ratones Mdx se trataron durante 30 días consecutivos con tubastatina A (TubA, APExBIO, n.º A4101; 25 mg/kg/día, por vía intraperitoneal) solubilizada en DMSO al 2 % o solución salina suplementada con DMSO al 2 % (control del vehículo)46. Estos ratones se mantuvieron en el Servicio Veterinario y de Cuidado de Animales de la Universidad de Ottawa. Todo el trabajo con animales ha cumplido con todas las normas éticas pertinentes. Después del tratamiento, los ratones fueron anestesiados con anestesia con isoflurano (referencia VI-1586 en el dispositivo TEM SEGA, MiniTag V1 / Evaporator Tec7) y fueron sacrificados por dislocación cervical. Luego, los músculos se diseccionaron y: (i) se congelaron y trituraron en nitrógeno líquido para la extracción de proteínas y ARN o (ii) se incluyeron en compuesto Tissue-Tek OCT (VWR, Mississauga, Canadá) y se congelaron en isopentano enfriado con nitrógeno líquido para criostato. seccionando57 o (iii) se disociaron manualmente80 con las siguientes modificaciones: las fibras TA individuales se fijaron 30 min a temperatura ambiente en PBS-4% paraformaldehído, se permeabilizaron 60 min en PBS-1% Triton X-100 a 30 °C antes de la saturación y la incubación con anticuerpos como se describe a continuación.

Todas las inyecciones y las pruebas de comportamiento se realizaron de manera ciega en las instalaciones centrales de comportamiento animal de la Universidad de Ottawa. Para los experimentos de TubA, se continuaron las inyecciones diarias durante el período de prueba de comportamiento. Para minimizar la interferencia, las inyecciones se realizaron por la tarde después de la finalización de cada prueba. Antes de cada prueba, los ratones se habituaron a la habitación durante al menos 30 minutos y las pruebas se realizaron en condiciones de luz normales. Los ratones se manipularon una vez al día durante 3 días antes de la primera prueba. La fuerza muscular de cada animal se midió utilizando un medidor de fuerza de agarre (Chatillion DFE II, Columbus Instruments) con todas las patas (prueba de fuerza de agarre de las patas traseras). El ratón se movió más cerca del medidor hasta que tuvo un agarre firme en la sonda. Se tiró del ratón horizontalmente lejos de la barra a una velocidad de ~2,5 cm/s, hasta que soltó la sonda. Se registró el valor de la fuerza pico máxima (gF). Esto se repitió ocho veces con intervalos de 15 segundos para cada animal. En cada animal a los 30 días, la mejor puntuación se definió como la fuerza máxima específica. Las mediciones de la fuerza de agarre fueron realizadas por el mismo investigador para limitar la variabilidad y se realizaron en un orden aleatorio. El investigador que realizó las mediciones desconocía el grupo de tratamiento de cada ratón individual al realizar la prueba.

Se sembraron células C2C12 (ATCC, CRL-1772) en placas recubiertas con matrigel (matrigel® matrix, Corning) de 35 mm de diámetro y se mantuvieron como mioblastos en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10 % y suero bovino fetal al 1 %. penicilina-estreptomicina (Multicell). Luego, las células se diferenciaron en medio de diferenciación (medio DMEM suplementado con suero de caballo al 2%, Bio Media Canada). Las células cultivadas en placas de 35 mm de diámetro se trataron por transferencia Western o inmunofluorescencia. Para el Western blot, las células se recogieron mediante tripsinización, se lavaron con PBS, se centrifugaron y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Para la inmunofluorescencia, las células se fijaron durante 20 min en PBS-paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente, se lavaron en PBS y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

Las células C2C12 se trataron con diferentes fármacos: TubA (a 5 µM, APExBIO, #A4101), tubacina (TBC, 5 µM, Sigma, #SML0065), rapamicina (rapa, 100 nM, Sigma #CAS 53123-88-9) y SB 431542 (SB43, 10 µM, Tocris, #1614). El TGF-β1 humano recombinante (rhTGF-β1, 10 ng/mL, #100-21) se adquirió de PeproTech. Todos los anticuerpos primarios utilizados en este estudio se presentan en la tabla complementaria 1. Los anticuerpos secundarios utilizados para los estudios de inmunofluorescencia se acoplaron a Alexa-Fluor 488 o Alexa-Fluor 555 (Molecular Probes); oa Cy3 o Cy5 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Los anticuerpos secundarios utilizados para la transferencia de Western fueron anticuerpos policlonales anti-IgG de conejo acoplados a peroxidasa de rábano picante (HRP) (Bio-Rad) o anticuerpos IgG anti-ratón de cabra HRP (Bio-Rad). Todos los anticuerpos utilizados en este estudio fueron validados por los fabricantes o en trabajos de laboratorio publicados anteriormente. Para visualizar la NMJ para los estudios de inmunofluorescencia, usamos α-bungarotoxina a 5 µg/ml de conjugados con Alexa-Fluor 488 (Molecular Probes, n.° B13422) y DAPI (Sigma-Aldrich; n.° D9542) para teñir el ADN nuclear. Para visualizar y cuantificar proteínas en Western blot, usamos 2,2,2-tricloroetanol122 (TCE, Sigma, #T54801).

Los músculos TA se recogieron de las patas traseras de ratones adultos y los músculos disecados se trituraron en hielo seco. El polvo muscular se resuspendió en tampón de urea/tiourea [7 M de urea, 2 M de tiourea, 65 mM de caps, 100 mM de DTT, 10 U de DNasa I, inhibidores de la proteasa (Complete; Roche/Sigma-Aldrich)] y la concentración de proteína se determinó usando CB- Kit de ensayo de proteínas X (G-Bioscience, St. Louis, MO). Después de la tripsinación, las células C2C12 se solubilizaron en tampón RIPA [Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NP-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, SDS al 0,1 % e inhibidores de la proteasa (Completo; Roche/Sigma-Aldrich) ]. La concentración de proteínas se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce/ThermoFisher Scientific) según las recomendaciones del fabricante.

Se separaron de cinco a veinte µg de proteínas totales mediante SDS-PAGE suplementado con TCE al 0,5 % y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa o PVDF. La unión no específica se bloqueó con albúmina de suero bovino al 4 % (BSA, Euromedex) diluida en PBS 1X complementado con Tween al 0,1 %, y las membranas se incubaron con anticuerpos primarios. Después de lavar a fondo con Tween 1X PBS al 0,1 %, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immunoresearch Laboratories/Cederlane). Después de lavados adicionales, las señales se revelaron usando reactivos de sustrato ECL (Bio-Rad) y las adquisiciones se realizaron usando ChemiDocTM MP Imaging Systems (Bio-Rad) o se autorradiografiaron con películas de rayos X (Fisher Scientific). Las cuantificaciones basadas en la membrana TCE se realizaron con el software Image Lab (Bio-Rad) o el software FIJI (ImageJ 2.0.0-rc-69/1.52n, National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Las muestras de músculo SOL y EDL congeladas se colocaron a -20 °C en el criostato (HM 525 NX, Thermo Fisher Scientific) durante al menos 20 minutos antes de su posterior procesamiento. Se cortaron transversalmente secciones de músculo de 10 µm de espesor. Las secciones transversales de los músculos se tiñeron con tintes de hematoxilina y eosina. Las secciones se deshidrataron usando soluciones de etanol al 70%, 90% y 100% y se lavaron con tolueno. Las secciones se montaron con Permount (Thermo Fisher Scientific) y se visualizaron con un microscopio invertido epifluorescente EVOS FLAuto2 en el Núcleo de adquisición de imágenes y biología celular de la Universidad de Ottawa (RRID: SCR_021845). El porcentaje de nucleación central se determinó contando el número total de fibras musculares y el número de fibras musculares nucleadas centralmente de 6 a 8 vistas transversales utilizando el software Northern Eclipse (NES, EMPIX Imaging). La tinción tricrómica de Masson se realizó en secciones transversales de criostato de sóleo y EDL en la instalación central de histología Louise Pelletier de la Universidad de Ottawa (RRID:SCR_021737). Las secciones se fijaron en solución de Bouin (75 ml de ácido pícrico saturado, 25 ml de formaldehído al 37–40 %, 5 ml de ácido acético glacial) durante 1 h a 56 °C y se enjuagaron con agua corriente hasta que desapareció el color amarillo. A continuación, las secciones se tiñeron con hematoxilina de Weigert (partes iguales de Solución A: 1 g de hematoxilina, 100 ml de alcohol al 95 % y Solución B: 4 ml de cloruro férrico al 29 %, 95 ml de agua destilada, 1 ml de ácido acético glacial) durante 10 min. y se lavó con agua corriente durante 10 min. Las secciones se tiñeron en solución de fucsina ácida escarlata de Biebrich (90 ml de escarlata Biebrich acuosa al 1 %, 10 ml de fucsina ácida acuosa al 1 %, 1 ml de ácido acético glacial) durante 2 min y se enjuagaron con agua. Los portaobjetos se incubaron en solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico (2,5 g de ácido fosfomolíbdico, 2,5 g de ácido fosfotúngstico, 120 ml de agua destilada) durante 10 a 15 min, se tiñeron con solución de azul de anilina (2,5 g de azul de anilina, 2 ml de ácido acético glacial, 100 ml de agua destilada labrada) durante 5 min, enjuagar, colocar en solución de ácido acético al 1% durante 3-5 min, deshidratar con alcohol etílico al 95% y absoluto, aclarar con xileno y montar con cubreobjetos. Se tomaron imágenes de las secciones con un Zeiss Axio Scan. Z1 equipado con un objetivo Plan-Apochromat 20x/0.8. Los núcleos se tiñen de negro, el citoplasma de rojo y el colágeno de azul.

Las incubaciones con anticuerpos primarios en PBS-Tween 20 al 0,1 % se realizaron a temperatura ambiente durante 60 min (células C2C12) oa 4 °C durante la noche (fibras musculares disociadas aisladas) y se lavaron. Después de la incubación durante 1 a 3 horas a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios fluorescentes, el ADN nuclear se tiñó con DAPI durante 10 min. Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de microscopio con reactivo FluorSaveTM (Calbiochem). Las imágenes se capturaron en RT en un microscopio Zeiss LSM880 (Carl Zeiss) con un detector AiryScan1 equipado con un objetivo de 63 × 1,4-NA en INMG o en un microscopio vertical Zeiss Axio Imager M2 (Carl Zeiss) equipado con un microscopio vertical de 63 × 1,4- Objetivos NA o 10 × 0,45 NA y detector CCD AxioCam mRm en las instalaciones centrales de adquisición de imágenes y biología celular de la Universidad de Ottawa (RRID: SCR_021845). Todas las imágenes se procesaron con el software ZEN blue, el software Zeiss AxioVision (Zeiss, Oberkochen, Alemania), Photoshop CS5 (Abobe Systems, San Jose, CA, EE. UU.) o el software FIJI (ImageJ 2.0.0-rc-69/1.52n , Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD). Las imágenes se analizaron de manera ciega cambiando aleatoriamente los nombres de los archivos con números usando la macro 'name_randomizer' en ImageJ80.

Las células C2C12 se pretrataron con TubA durante 24 h y luego se trataron durante 30 min con TGF-ß1. A continuación, las células se recogieron y sedimentaron a 300 g a 4 °C durante 3 min. Los sedimentos se resuspendieron con 10 volúmenes de tampón E1 enfriado con hielo (NaOH 20 mM pH 7,6, acetato de potasio 5 mM, MgCl2 0,5 mM) complementado con 1 cóctel de inhibidor de proteasa y 1 cóctel de inhibidor de fosfatasa y se colocó en un homogeneizador Dounce de 1 ml. Las células se homogeneizaron con 25 golpes del mortero suelto y se incubaron 10 min en hielo antes de la centrifugación a 2100 × g a 4 °C durante 3 min. Se recogió el sobrenadante (extracto de citoplasma, CE) y se resuspendió el sedimento en el mismo volumen de tampón E1 suplementado con NaCl 600 mM. La suspensión se incubó 30 min en hielo y se centrifugó a 20 000 × g durante 20 min. Se recogió el sobrenadante (extracto nuclear, NE) y el sedimento se resuspendió en el mismo volumen de tampón E1 suplementado con NaCl 600 mM y Benzonase (1/1000, Millipore, 71205) y correspondía al extracto de cromatina (Chrm). El mismo volumen de cada fracción se cargó en geles Any kD Mini PROTEAN TGX (Biorad), se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se reveló con el anticuerpo indicado.

Las inmunoprecipitaciones de cromatina (ChIP) de la proteína Smad2/3 ubicada en las secuencias promotoras de los atrógenos (MAFbx y MuRF1) se realizaron con el kit SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP (Cell Signaling Technology) de la siguiente manera: las células C2C12 se pretrataron o no se trataron con TubA por 24 h y luego con TGF-ß1 por 30 min. Las células se lavaron en 5 ml de medio de cultivo celular (DMEM Glutamax) en ausencia de suero bovino fetal. A continuación, las células se incubaron en DMEM Glutamax suplementado con paraformaldehído al 1 % durante 10 min a 25 °C. La reticulación se detuvo mediante la adición de glicina a una concentración final de 0,125 M y la incubación a 25 °C durante 15 minutos. Las células se recogieron en PBS 1X raspando las placas, se lavaron en PBS 1X y se resuspendieron en tampón de lisis celular de sonicación ChIP (SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit) que contenía cóctel inhibidor de proteasa 1X a una concentración de 2,107 células/ml. Después de 15 minutos en hielo, las células se recogieron mediante centrifugación durante 3 minutos a 3000 g, 4 °C y se resuspendieron de nuevo en tampón de lisis celular de sonicación ChIP que contenía cóctel inhibidor de proteasa 1X. Después de 5 minutos en hielo, este último paso se repitió por tercera vez durante 10 minutos. Las células se sometieron a ultrasonidos en un Covaris S220 en un tubo de 1 ml (potencia máxima: 140; factor de trabajo 10; ciclos/explosión: 200) durante 12 min a 4 °C. La eficiencia de la sonicación se controló en un gel de agarosa al 1% para verificar la presencia de fragmentos en el rango de 500-1000 pb y la concentración de cromatina se evaluó en una fracción desentrecruzada usando una nanogota. La inmunoprecipitación se realizó como se indica en el protocolo del kit ChIP CST mediante la incubación de 2,5 µg de cromatina con 10 µL de anticuerpo en un volumen final de 500 µl (ajustado con tampón de lisis de sonicación ChIP) durante 12 h a 4 °C con rotación. Los anticuerpos ChIP utilizados son: IgG (CST; #2729; como control negativo); Histona H3 (CST; #4620, como control positivo); Smad 2/3 (CST; #8685). Los fragmentos inmunoprecipitados se recuperaron, purificaron y desentrecruzaron de acuerdo con el protocolo del kit CST. La presencia de ADN fue detectada por QPCR (Biorad CFX Connect) usando SsoADV Universal SYBR Green Supermix (Biorad) y los siguientes primers (Eurogentec): MAFbx promotor region −205/−319 (Fbxo32-5F: 5'TTCCTTGCTACACCCTGCTT3'; Fbxo32- 5R: 5'ACCTCTGCACCTCCCCTACT3'); región promotora MAFbx −424/−618 (Fbxo32-2F: 5'CTTCTTTCCCCTTCCTTTGC3'; Fbxo32-2R: 5'GGTAGGGGTGCATTCTTTGA3'); región promotora no relacionada de MAFbx -1232/-1320 (Fbxo32-7F:5'GGCCTGCCAGTACAGACAAT3'; Fbxo32-7R: 5'AGGTGTCTTCCTTGCTCACG3'); Región promotora MuRF1 −608/−727: (Trim63-2F: 5'CAGCACAAGGGTGTTCATGT3'; Trim63-2R: 5'CTCAGTGGTAAAGGGGCTTG3'); Región promotora no relacionada de MuRF1 −1805/−1978: (Trim63-9F: 5' GTGGATGCCAGGAACTGAAT'; Trim63-9R: 5' GGCGTCCTGGAACTCACTC3').

Usando ImageJ, la organización de los microtúbulos se visualizó con escaneos de líneas verticales (barras amarillas) y horizontales (barras azules). Usando una herramienta de análisis de direccionalidad desarrollada recientemente81 (TeDT), se calculó la direccionalidad de la red de red de microtúbulos para todas las líneas de ratón. Se usó un ANOVA de dos vías para evaluar el efecto del ángulo de intersección de los microtúbulos entre los grupos. Se utilizaron medidas post hoc de la prueba U bilateral (Mann-Whitney) para determinar el alcance de las diferencias entre los grupos. La significación se fijó en P < 0,05.

Para un análisis preciso, cada imagen se capturó con una sola NMJ en la cara. Las UNM que eran parcialmente oblicuas al campo de visión solo se incluyeron si la porción oblicua constituía menos de aproximadamente el 10 % del área total. Para cuantificar la compacidad y el índice de fragmentación, las imágenes se analizaron gracias a la metodología 'NMJ-morph'123. La compacidad de los AChR en la placa terminal se definió de la siguiente manera: Compacidad \(=\,\left(\frac{{{{{{\rm{AChR}}}}}}\; {{{{{\rm{area }}}}}}}{{{{{{\rm{endplate}}}}}}\; {{{{{\rm{área}}}}}}}\right)\,\times 100\ ).

El índice de fragmentación se calculó mediante el cual una placa terminal sólida similar a una placa tiene un índice de (0), y una placa terminal altamente fragmentada tiene un índice que tiende hacia un valor numérico de (1): Índice de fragmentación \(=\,1-\left(\ frac{1}{{{{{{\rm{número}}}}}}\; {{{{{\rm{de}}}}}}\; {{{{{\rm{AChR}} }}}}\; {{{{{\rm{cluster}}}}}}}\right)\).

Las dimensiones básicas de la placa terminal del motor postsináptico se midieron utilizando funciones estándar de ImageJ. 'NMJ-morph' se utiliza para cuantificar el número de grupos discretos de AChR que comprenden la placa motora.

Todos los análisis estadísticos se realizaron con Prism 6.0 (GraphPad Software, La Jolla, EE. UU.). Se aplicó la prueba no paramétrica de la U bilateral (Mann-Whitney). Para un análisis de varianza factorial múltiple, se aplicó ANOVA de dos vías. Los valores de P inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos (se muestran como un solo asterisco en las cifras).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento. No hay restricciones sobre la disponibilidad de datos en este manuscrito. Los datos sin procesar generados principalmente en este estudio se proporcionan en la Información complementaria como un archivo de datos de origen. Las cifras complementarias se proporcionan al final del archivo de información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a John Lunde, Jean Luc Thomas, Amanda Tran, Laurent Coudert, Nawres Ben Marzouk y Jacques Brocard por su ayuda técnica experta y debates fructíferos. Agradecemos a las instalaciones de microscopía PLATIM y CIQLE de Lyon y al Núcleo de adquisición de imágenes y biología celular de la Universidad de Ottawa (RRID: SCR_021845) por el acceso a los microscopios. La financiación de este trabajo se obtuvo a través de una subvención de la Association Française contre les Myopathies (AFM telethon) a BJJAO que se benefició de una beca posdoctoral de la AFM durante el transcurso de este trabajo. El apoyo adicional para este trabajo provino del teletón AFM a través de la alianza estratégica MyoNeurALP, la Fondation pour la Recherche Médicale a través de un financiamiento "équipe FRM" a LS y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud a BJJ

Estos autores contribuyeron igualmente: Bernard J. Jasmin, Laurent Schaeffer.

Fisiopatología y genética de neuronas y músculos (INMG-PGNM), CNRS UMR 5261, INSERM U 1315, Université de Lyon, Lyon, Francia

Alexis Osseni, Edwige Belotti, Isabella Scionti, Yann-Gaël Gangloff, Vincent Moncollin, Laetitia Mazelin, Remi Mounier, Pascal Leblanc y Laurent Schaeffer

Centro de Biotecnología Celular, Hospices Civils de Lyon, Lyon, Francia

Alexis Osseni y Laurent Schaeffer

Departamento de Medicina Celular y Molecular, Facultad de Medicina, 451 Smyth Road, Universidad de Ottawa, Ottawa, ON, K1H 8M5, Canadá

Aymeric Ravel-Chapuis y Bernard J. Jasmin

Centro Éric Poulin para Enfermedades Neuromusculares, Facultad de Medicina, Universidad de Ottawa, Ottawa, ON, K1H 8M5, Canadá

Bernard J. Jazmín

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AO, BJJ y LS concibieron el estudio, diseñaron el proyecto y obtuvieron subvenciones. AO y ARC realizaron inmunofluorescencia y todos los experimentos con animales. AO y EB realizaron experimentos de fraccionamiento celular. AO e IS realizaron experimentos con TGF-β. AO, LM y YGG realizaron experimentos mTOR. AO y PL realizaron todos los Western blot. AO y VM realizaron experimentos ChIP. AO realizó todos los experimentos con células de cultivo. AO creó las Figs. 1a y 6 en Adobe Illustrator. AO y LS escribieron el primer borrador del manuscrito. AO, ARC, EB, IS, YGG, VM, LM, RM, PL, BJJ y LS analizaron, interpretaron los datos, revisaron, finalizaron el manuscrito y proporcionaron comentarios y ediciones.

Correspondencia a Alexis Osseni, Bernard J. Jasmin o Laurent Schaeffer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Chiara Mozzetta y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Osseni, A., Ravel-Chapuis, A., Belotti, E. et al. La inhibición farmacológica de HDAC6 mejora los fenotipos musculares en ratones con deficiencia de distrofina mediante la regulación negativa de TGF-β a través de la acetilación de Smad3. Nat Comun 13, 7108 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34831-3

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Recibido: 28 enero 2022

Aceptado: 01 noviembre 2022

Publicado: 19 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34831-3

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