Conocimientos estructurales y mecanicistas sobre β fúngico

Nature, volumen 616, páginas 190–198 (2023)Citar este artículo

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La sintasa FKS integrada en la membrana participa en la biosíntesis de β-1,3-glucano, el componente central de la pared celular fúngica1,2. FKS es el objetivo de los fármacos antimicóticos ampliamente prescritos, incluidas la equinocandina y la ibrexafungerp3,4. Desafortunadamente, el mecanismo de acción de FKS sigue siendo enigmático y esto ha obstaculizado el desarrollo de medicamentos más efectivos dirigidos a la enzima. Aquí presentamos las estructuras de microscopía crioelectrónica de Saccharomyces cerevisiae FKS1 y el mutante resistente a equinocandina FKS1 (S643P). Estas estructuras revelan el sitio activo de la enzima en la interfase membrana-citoplasma y una ruta de translocación de glucano que atraviesa la bicapa de la membrana. Se observan múltiples lípidos unidos y notables distorsiones de membrana en las estructuras de FKS1, lo que sugiere interacciones activas de FKS1-membrana. Las mutaciones resistentes a la equinocandina se agrupan en una región cerca de TM5–6 y TM8 de FKS1. La estructura de FKS1 (S643P) revela arreglos de lípidos alterados en esta región, lo que sugiere un mecanismo resistente a los medicamentos de la enzima mutante. Las estructuras, el mecanismo catalítico y los conocimientos moleculares sobre las mutaciones resistentes a los medicamentos de FKS1 revelados en este estudio avanzan en la comprensión mecánica de la biosíntesis de β-1,3-glucano fúngico y establecen una base para desarrollar nuevos medicamentos antimicóticos dirigidos a FKS.

Las infecciones fúngicas invasivas causan más de 1,5 millones de muertes al año, lo que representa una grave amenaza para la salud pública5. Tales infecciones son motivo de gran preocupación (por ejemplo, causan una alta mortalidad) para las poblaciones inmunocomprometidas, así como para los pacientes con COVID-19 (refs. 5,6) (https://www.cdc.gov/fungal/covid-fungal.html ). Las clases limitadas de medicamentos antimicóticos y las cepas emergentes resistentes a los medicamentos, como el reciente brote de Candida auris resistente a múltiples medicamentos, han causado serios desafíos en el tratamiento de pacientes infectados7,8. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de desarrollar nuevos agentes antifúngicos8.

El β-1,3-glucano es un componente fundamental de la pared celular fúngica2, por lo que apuntar a su biosíntesis es una estrategia importante para desarrollar fármacos antifúngicos de amplio espectro3,9. El β-1,3-glucano de la pared celular fúngica es sintetizado por la sintasa FKS10,11 integrada en la membrana, que está regulada por GTPasa Rho1 (refs. 12,13). FKS transfiere la glucosa de la UDP-glucosa del donante a la cadena creciente de glucano a través de enlaces glucosídicos β-1,3 y transloca el glucano β-1,3 polimerizado al espacio extracelular (Fig. 1a). Se han identificado ortólogos de FKS en todos los hongos analizados y son esenciales para la viabilidad de muchos patógenos fúngicos prominentes. En Candida glabrata y S. cerevisiae, la interrupción simultánea de FKS1 y FKS2 mostró un fenotipo letal14,15; FKS1 de Candida albicans y Cryptococcus neoformans son esenciales para la viabilidad16,17; el moho Aspergillus fumigatus con una deleción FKS1 sufre severos defectos de crecimiento y lisis celular18. Actualmente, hay dos fármacos antimicóticos bien conocidos en el mercado que se dirigen a FKS: la equinocandina, el fármaco antimicótico de primera línea ampliamente utilizado en la práctica clínica19, y el ibrexafungerp, un fármaco fungicida oral recientemente aprobado4. Más agentes novedosos dirigidos a la función FKS (por ejemplo, rezafungina) están entrando en ensayos clínicos en etapa avanzada4. Desafortunadamente, las mutaciones de FKS están estrechamente relacionadas con la resistencia a las equinocandinas y el fracaso terapéutico, una preocupación emergente en las infecciones fúngicas invasivas20,21. Numerosas mutaciones resistentes a las equinocandinas identificadas clínicamente se concentran en tres regiones conservadas de FKS20,22. Las mutaciones en un solo alelo FKS son suficientes para hacer que las cepas fúngicas sean resistentes a la equinocandina23.

a, Modelo de la pared celular fúngica. FKS1 usa UDP-Glc para sintetizar β-1,3-glucano. El gráfico en el panel a fue creado usando BioRender (https://biorender.com). b, Ensayo in vivo de FKS1 examinando el crecimiento de la cepa WT y la cepa FKS1-KO (KO) con o sin el inhibidor de FKS2 FK506. Los datos son media ± sem; n = 3 experimentos independientes. c, Actividad in vitro de FKS1 purificada con CHAPS con diferentes efectores: UDP-Glc, Rho1, GTPγS y fármacos antifúngicos (caspofungina (CFN) y micafungina (MCF)). La actividad se midió monitoreando el UDP generado. Los datos son media ± sem; n = 3 experimentos independientes. d, e, digestión enzimática del polímero insoluble en agua sintetizado por FKS1 (S643P) purificado con GDN. Se utilizaron endo-1,3-β-glucanasa y endo-1,4-β-glucanasa específicas. Estos experimentos fueron repetidos tres veces con resultados similares. Se muestra una imagen representativa de la digestión de polímeros (d) y las muestras de hidrólisis en d retiradas en los tiempos indicados y sujetas a análisis de cromatografía de capa fina (e). Se usaron glucosa (G1), laminaribiosa (G2), laminaritriosa (G3) y laminarihexaosa (G6) como patrones (carril M). f, Análisis de enlace de glucosilo (metilación) del polímero sintetizado por FKS1 (S643P) purificado con GDN. Se muestra un perfil de cromatograma de gases de los acetatos de alditol parcialmente metilados derivados de los polímeros sintetizados. El pico dominante (delineado por un cuadro discontinuo verde) representa el enlace 1,3-Glcp, confirmado por espectrometría de masas (Datos extendidos Fig. 2d). g, Esquema de la organización del dominio de FKS1. h, mapa Cryo-EM de FKS1, visto paralelo a la membrana. El mapa está segmentado en cuatro partes coloreadas en g con densidades similares a lípidos en amarillo claro. i, Dos vistas ortogonales de la estructura FKS1 en dibujos animados. Cuatro partes de FKS1 están coloreadas como en g. j, Vista intracelular de la región citoplasmática con el dominio TM oculto. La hoja β central del dominio FKS1 GT está compuesta por β3–β11 como se indica. Las líneas discontinuas indican regiones desordenadas.

La falta de una estructura FKS ha dificultado nuestra comprensión del mecanismo catalítico de FKS y ha obstaculizado el desarrollo de nuevos fármacos antimicóticos. FKS es una proteína integrada en la membrana de aproximadamente 200 kDa con homologías de secuencia baja con otras glicosiltransferasas (GT) caracterizadas. FKS pertenece a la familia GT48 sin estructuras disponibles para ninguno de sus miembros. Aquí informamos las estructuras de microscopía crioelectrónica (crio-EM) de S. cerevisiae FKS1 y su mutante resistente a los medicamentos FKS1 (S643P). Otras caracterizaciones funcionales guiadas por la estructura nos permiten dilucidar la base molecular de la biosíntesis de β-1,3-glucano por FKS1 y racionalizar las mutaciones resistentes a los medicamentos de la enzima.

Para los estudios funcionales in vivo, combinamos la eliminación genética de FKS1 con la manipulación farmacológica de FKS2 para eludir el fenotipo letal causado por la interrupción simultánea de FKS1 y FKS2 en S. cerevisiae15. La cepa de tipo salvaje (WT) mostró un crecimiento moderadamente lento con el inhibidor FK506 específico de FKS2 (refs. 15, 24) (Fig. 1b). Por el contrario, la cepa FKS1-knockout (KO) exhibió un crecimiento significativamente reducido sin FK506 y una inhibición del crecimiento casi total con FK506.

A continuación, inmunopurificamos el FKS1 de S. cerevisiae expresado endógenamente en el detergente CHAPS, que se usa con frecuencia para el ensayo de actividad de FKS113,25 (ver Métodos). Tradicionalmente, la actividad de FKS se mide mediante un método radiactivo en membrana cruda o FKS13,25,26 atrapado en el producto, y aquí descubrimos que monitorear el UDP generado puede hacer un sistema práctico sin radiomarcador para el ensayo de actividad de FKS1. FKS1 solo no exhibió actividad aparente. La adición de Rho1 purificado en la forma cargada de GTPγS aumentó drásticamente la actividad de FKS1 (Fig. 1c), lo que confirma el papel regulador esencial de Rho1 en FKS1 (refs. 12, 13). La actividad específica de WT FKS1 se determinó en aproximadamente 824 nmol min−1 mg−1, que es comparable con estudios previos10,25,27. Más importante aún, la adición de caspofungina o micafungina, dos fármacos antimicóticos ampliamente utilizados que pueden inhibir la síntesis de β-1,3-glucano19, redujo significativamente la actividad de FKS1.

Para confirmar aún más el papel de FKS1 en la síntesis de β-1,3-glucano, analizamos el producto formado por FKS1 purificado. Para este propósito, probamos WT FKS1 y la variante FKS1 (S643P), que es una de las mutaciones resistentes a equinocandina observadas con mayor frecuencia28. Presumimos que la última variante puede alterar el comportamiento de la sintasa. Cuando se purificaron hasta la homogeneidad en el detergente GDN (datos extendidos, Fig. 1a-d y figura complementaria 1), tanto WT FKS1 como FKS1 (S643P) exhibieron actividad, que puede agotarse por inmunodepleción (datos extendidos Fig. 1h-j). Descubrimos que el FKS1 purificado por GDN puede activarse con caspofungina. Caspofungin puede estimular la actividad de FKS1 (S643P) (datos extendidos Fig. 1h-j). Esto se confirma aún más mediante la síntesis de productos a escala en la que solo FKS1 (S643P) con caspofungina produjo una cantidad significativa de polímero insoluble en agua (Datos ampliados, Fig. 1k). El hecho de que la enzima purificada en GDN y en CHAPS se comporte de manera muy diferente (datos extendidos Fig. 1i versus Fig. 1c) sugiere que la función FKS1 puede ser sensible a los entornos de membrana. La síntesis del producto por FKS1 (S643P) exhibe especificidad de donante hacia el ligando preferido UDP-Glc sobre UDP-GlcNAc (Datos extendidos Fig. 1l). Además, el EDTA puede respaldar la actividad catalítica de la enzima y el Mg2+ inhibió significativamente la actividad (Datos ampliados, Fig. 1m), en consonancia con estudios previos25,29,30. La introducción de una mutación K1261A, una mutación de inactivación de enzimas descubierta a partir de nuestro análisis estructural (consulte la sección 'El sitio activo y el mecanismo catalítico'), a FKS1 (S643P) inactivó por completo la actividad de síntesis del producto de la enzima hiperactiva (Datos extendidos Fig. 1h –k). Los ensayos anteriores ilustran la actividad enzimática específica de FKS1.

Para confirmar la formación del enlace glucosídico β-1,3, realizamos un ensayo de hidrólisis en el polímero sintetizado por FKS1 (S643P). Como resultado, la endo-1,3-β-glucanasa puede hidrolizar completamente el polímero, mientras que la endo-1,4-β-glucanasa no puede (Fig. 1d y Datos ampliados Fig. 2a). El análisis de cromatografía de capa fina mostró que el hidrolizado catalizado por endo-1,3-β-glucanasa de nuestro polímero sintetizado coincide con el patrón de hidrolizado de curdlan (el estándar de β-1,3-glucano) (Fig. 1e y Datos extendidos Fig. 2b,c). Además, el análisis de enlace de glicosilo de metilación mostró que 1,3-Glcp es el enlace dominante en el polímero sintetizado (Fig. 1f y Datos extendidos Fig. 2d). En resumen, los estudios bioquímicos y químicos anteriores juntos establecen firmemente que FKS1 es una β-1,3-glucano sintasa.

Para comprender mejor el mecanismo de FKS1, determinamos la estructura crio-EM de FKS1 purificado por GDN a una resolución general de 3.4 Å (Fig. 1g, h, Tabla de datos extendidos 1 y Datos extendidos Fig. 3). El mapa de densidad permitió la construcción de novo de un modelo atómico de FKS1 con la mayoría de los residuos resueltos (Datos extendidos Fig. 4). Hasta donde sabemos, representa la primera estructura de los GT de membrana de la familia GT48.

La estructura general de FKS1 mide aproximadamente 100 Å × 115 Å × 100 Å (Fig. 1i). Contiene un dominio transmembrana (TM) con 17 hélices TM (TM1–17) y una entidad citoplasmática voluminosa. El dominio TM adopta una forma de cuña, con su extremo más estrecho (aproximadamente 35 Å) en el lado extracelular. FKS1 no tiene dominios estructurados extracelulares aparentes y varios bucles alargados conectan las hélices TM. Hay varias regiones no estructuradas, detalladas en la sección Métodos 'Construcción y refinamiento de modelos'.

La parte citoplásmica de FKS1 contiene un dominio N-terminal y un dominio medio, separados por TM1–6 en la secuencia primaria (Fig. 1g). El dominio medio (residuos 712–1266) adopta un pliegue GT-A característico de los GT: una hoja β central continua de nueve hebras (β3–β11) rodeada por múltiples hélices α31 (Fig. 1j y Datos extendidos Fig. 3h) . Por lo tanto, se denomina dominio GT. El dominio N-terminal (residuos 146–442) contiene 14 hélices α (la hélice 6–7 no está modelada debido a la falta de densidades) (Datos extendidos Fig. 3i). Una búsqueda con el servidor Dali no pudo recuperar ninguna estructura similar a este dominio. Por lo tanto, lo llamamos dominio accesorio (AC). El dominio AC interactúa ampliamente con el dominio GT, enterrando un área de superficie de interfaz total de 2504 Å2. Tres bucles del dominio GT (bucle que conecta β5 y β6 (Lβ5–β6), Lβ7–β8 y Lβ8–β9) funcionan como pinzas para sujetar el dominio AC (Fig. 1j). El R319 altamente conservado del dominio AC interactúa con N1087 del dominio GT en la interfaz del dominio (Datos extendidos Fig. 3j). Se ha demostrado previamente que la sustitución R319A reduce significativamente la función de FKS124, lo que indica que los dos dominios citoplasmáticos funcionan juntos como una unidad estructural compacta.

Del total de 17 hélices TM en FKS1, TM1–8 proporciona la mayor parte de la interfaz de interacción con la entidad citoplásmica (Fig. 2a, b y Datos extendidos Fig. 3i). TM1-4 forman un paquete helicoidal apretado, en contacto con TM5-7 en un lado (Fig. 2c). TM5-17 están todos inclinados como pétalos de flores abiertos cuando se ven desde el lado citosólico (Fig. 2a, c). Entre el TM5-17 inclinado y el dominio GT hay una gran cámara expuesta al solvente, que es parte del sitio activo de la enzima (ver más abajo). El dominio TM presenta dos bolsillos incrustados en la membrana (Fig. 2a). El bolsillo en el lado extracelular se forma porque TM9–10 y TM12 expuestos a la membrana son significativamente más cortos que las hélices típicas de TM. El otro bolsillo en el lado citosólico se forma debido a la inclinación de las hélices TM. Estos dos bolsillos juntos probablemente forman un camino para la translocación de glucano (ver más abajo). Además, cinco bucles extracelulares largos (EL1–5) se entrelazan para estabilizar los extremos extracelulares cercanos de TM5–17. En estos bucles se encuentran dos enlaces disulfuro conservados (C658-C669 en EL1 y C1328-C1345 en EL2) y un glicano potencial unido a N en el N1849 conservado (Fig. 2a, b). La inclinación de TM5-17 da como resultado grandes distancias entre hélices vecinas en el extremo citosólico (Fig. 2c). Los amplios espacios resultantes creados se llenan con tres hélices laterales (LH1–3) paralelas a la bicapa de la membrana: LH1–2 llenan el gran espacio creado por dos láminas de tres hélices (TM11, TM12 y TM16; y TM14, TM15 y TM17). ), mientras que LH3 rellena los extremos de LH1–2.

a, Vista frontal de FKS1. Diecisiete hélices TM (indicadas por números) están en representación de dibujos animados; los dominios citoplasmáticos AC y GT están en cintas amarillas y azules, respectivamente. Los enlaces disulfuro conservados en EL1-2 y el glicano unido a N en N1849 conservado de EL5 están marcados. Los lípidos ordenados están en barras amarillas. Los tres óvalos marcan las posiciones de los tres bolsillos implicados en la catálisis (un bolsillo verde) y la translocación de glucano (dos bolsillos grises). b, Diagrama topológico del dominio FKS1 TM. Las líneas discontinuas representan los elementos flexibles invisibles en el mapa. c, Vista citosólica de las hélices FKS1 TM. El recuadro muestra la misma vista que en a con la región citosólica oculta. Los dos círculos con diámetros aproximados resaltan la inclinación de TM5–17, abriéndose hacia el citoplasma. d, Los residuos (mostrados como barras) que interactúan con el fosfolípido interno (PL) están delineados por el recuadro sólido en a. e, Vista posterior de la membrana de la región enriquecida en lípidos delineada por el cuadro discontinuo en a. f-i, Comparación de los supuestos pliegues compartidos entre FKS1 (familia GT48) (f) y tres sintasas unidas a la membrana de la familia GT2: la celulosa sintasa bacteriana BcsA (Banco de datos de proteínas (PDB) ID: 4hg6) (g), la planta celulosa sintasa CesA (PDB ID: 6wlb) (h) y la hialuronano sintasa HAS (PDB ID: 7sp7) (i). Las estructuras superpuestas se muestran por separado en representación de dibujos animados. Sus elementos correspondientes están en el mismo esquema de color, mientras que los elementos fuera del pliegue compartido están en superficie gris o representación de dibujos animados como están etiquetados. En f, las líneas discontinuas indican regiones desordenadas. j–m, Comparación de los arreglos de TM en FKS1 (j), BcsA (k), CesA (l) y HAS (m). Los segmentos de TM en la sombra gris pertenecen al pliegue compartido. Las hélices TM se indican con números. El asterisco marca la ruta de translocación de glucano propuesta en FKS1, BcsA, CesA y HAS.

La resolución del mapa FKS1 nos permitió identificar múltiples lípidos unidos ordenadamente (Fig. 2a y Datos extendidos Fig. 4g, h). Un fosfolípido en la membrana citosólica se pone en contacto con TM11, TM15–16 y LH2 (Fig. 2d). Su grupo de cabeza está preparado para contactar los residuos cargados R1455 (TM11) y R1684 (TM16). Sus dos colas de alquilo de lípidos se empaquetan con residuos hidrofóbicos circundantes: H1654, I1655 y F1658 (TM15); I1680 (TM16); y V1745 y L1746 (LH2). Además de LH1-2, este fosfolípido también parece contribuir a la estabilización de la disposición inclinada de las hélices TM (Fig. 2a). Otras densidades similares a lípidos se modelaron como 24 cadenas de alquilo de lípidos, predominantemente ubicadas alrededor de un núcleo compuesto por TM5-13 (Fig. 2c). De estos, siete lípidos envuelven TM5-6 (Fig. 2c) y 12 forman dos capas que llenan la superficie cóncava creada por las hélices de TM inclinadas (Fig. 2e). Estas moléculas lipídicas bien definidas son probablemente parte de la estructura integral de FKS1.

Aunque la arquitectura de FKS1 es radicalmente diferente de las GT unidas a la membrana con estructuras conocidas, notamos que una parte de la estructura de FKS1 (residuos 615–1510) se parece a las topologías generales de dos celulosa sintasas de la familia GT2: la bacteria BcsA y su homólogo de la planta CesA32,33 (Fig. 2f-h). A pesar de sus identidades de secuencia baja (menos del 10 %), FKS1 y BcsA se pueden superponer con un valor de desviación cuadrática media de 4,3 Å sobre 308 residuos alineados (datos extendidos, figura 5a). Una búsqueda de estructuras homólogas de DALI identificó dos estructuras adicionales que se asemejan a esta topología: hialuronano sintasa (HAS) y doliquifosfato manosa transferasa (PcManGT). De manera consistente, se ha informado HAS con una similitud estructural general con BcsA34 (Fig. 2i, m); Se ha propuesto que PcManGT contenga un pliegue mínimo similar a la celulosa sintasa con BcsA35. Estos implican además que estas polisacáridos sintasas unidas a la membrana (FKS1, BcsA, CesA y HAS) pueden compartir un pliegue central, al que nos referimos como un pliegue similar a la celulosa sintasa. Este pliegue comparte varias características: está compuesto por seis hélices TM, con el dominio GT dividiendo las dos hélices N-terminales de las cuatro hélices C-terminales (Fig. 2j-m); el límite membrana-citosol contiene varias hélices de interfaz anfipáticas (IF) (Fig. 2f-i); cerca de este límite, la hélice TM que sigue al dominio GT (FKS1 TM7, BcsA TM5, CesA TM3 y HAS TM3) se alarga y se ha propuesto que recubre la ruta de translocación de glucano32,33,34.

A pesar de la semejanza general de este pliegue modular, se revelaron características específicas considerables de FKS1 (Datos extendidos Fig. 5). El dominio GT gana extensiones considerables en relación con BcsA (datos extendidos Fig. 5a, b), y las hélices TM topológicamente correspondientes entre FKS1 y BcsA varían en orientación y longitud (datos extendidos Fig. 5c). Las variaciones más notables se encuentran en la interfaz membrana-citoplasma. BcsA, CesA y HAS presentan tres IF anfipáticos similares (IF1–3)33,34,36 (Fig. 2g–i). En FKS1, la contraparte topológica de IF3 se convierte en hélices TM (TM9–10) en su lugar (Datos extendidos Fig. 5d, e). Aunque IF1-2 se conservan en FKS1, muestran estados distintos. IF1 (es decir, la hélice α33 del dominio GT) de FKS1 gira casi 90 ° y está intercalado entre TM6 y TM8 (Datos extendidos Fig. 5d). IF2 de BcsA corresponde a los residuos 1247-1266 de FKS1, que están desordenados en el mapa, aunque se predice como una hélice (Datos extendidos, Fig. 5c). Este FKS1 IF2 putativo carece del motivo 'QxxRW' conservado entre BcsA, CesA y HAS33,34,36 pero aún podría contribuir a la catálisis, como veremos más adelante.

Dentro del pliegue similar a la celulosa sintasa, FKS1 contiene una gran cámara expuesta al solvente en la interfaz membrana-citoplasma (Fig. 3a). La alineación de este pliegue con el de BcsA revela que la cámara en FKS1 se superpone bien con el sitio activo de BcsA unido a UDP, lo que indica claramente que la cámara es el sitio activo de FKS1 (Fig. 3b). Una búsqueda DALI recuperó estructuras homólogas del dominio FKS1 GT (residuos 718–1239): PcManGT, BcsA, GalNAc-T7, TarP, CesA y HAS. También analizamos el modelo AlphaFold de curdlan sintasa porque sintetiza el mismo polímero que FKS1 y muestra una alta homología (26% de identidades) con BcsA37. Las comparaciones estructurales detalladas de estos objetivos revelaron que el sitio activo de FKS1 se superpone mejor con enzimas unidas a la membrana como BcsA, CesA, curdlan sintasa, HAS y PcManGT (datos extendidos, figura 6). A pesar de la diferente estereoquímica de sus productos, la gran similitud estructural de sus sitios activos indica mecanismos similares en la unión al sustrato y la catálisis de estas sintasas, en consonancia con estudios previos de BcsA, CesA y HAS33,34,36. Sobre la base de estos conocimientos, superpusimos las estructuras de FKS1 y BcsA para revelar los residuos clave funcionalmente importantes compartidos en sus sitios activos (Fig. 3c, d). Por ejemplo, dos pares de residuos (Y849 y E851, y K1082 y N1085 en FKS1; Y149 y E151, y K226 y N229 en BcsA) y el 'motivo ED' (E1221 y D1222 en FKS1; y E342 y D343 en BcsA) en las dos enzimas se pueden alinear bien. Estos residuos en BcsA son conocidos por la unión de donantes (Y149 y E151, y K226 y N229 en BcsA) y por posicionar la base catalítica general aspartato (motivo ED)36.

a, Una representación de superficie recortada de FKS1 que muestra el sitio activo en la interfaz membrana-citoplasma. Conecta un bolsillo de membrana, que tiene el potencial para la translocación de glucano. Los elementos estructurales específicos se muestran en representación de dibujos animados, coloreados como en la Fig. 2a. Las hélices TM se indican con números. El motivo ED altamente conservado (E1221 y D1222) ubicado en la hélice α35 está frente al sitio activo como está marcado. b, Dominios GT superpuestos de los pliegues similares a la celulosa sintasa compartidos entre BcsA unido a UDP (ID de PDB: 4P00; en gris con UDP en la barra magenta) y FKS1 (en naranja). c, d, vista de primer plano de los sitios activos entre BcsA (c) y FKS1 (d), como se indica en el cuadro discontinuo en b. Los residuos implicados en la unión o catálisis del sustrato se indican como barras. En c, UDP se muestra como la barra magenta. En d, los residuos de FKS1 conservados con BcsA se destacan como barras amarillas. e, Ensayo funcional in vivo de mutaciones del sitio activo en FKS1. El crecimiento de las cepas indicadas durante 72 h se analizó sin (rango izquierdo) y con (rango derecho) el inhibidor FK506 específico de FKS2. La prueba se repitió tres veces con resultados similares. f, Niveles de glucano de la pared celular en cepas que portan las mutaciones FKS1 indicadas. g, actividades in vitro de FKS1 de WT y mutantes del sitio activo purificados con CHAPS, con o sin el inhibidor de FKS1 CFN. Las actividades se normalizaron a la cantidad de proteína. Para f,g, los datos son la media ± sem; n = 3 experimentos independientes.

A continuación, validamos los roles funcionales de estos residuos utilizando tres ensayos diferentes. Primero, introdujimos sus mutaciones en el locus cromosómico FKS1 y analizamos el fenotipo de crecimiento de cada cepa mutante en presencia de FK506 (Fig. 3e). Las mutaciones dobles de Y849A;E851A y K1082A;N1085A y las mutaciones simples de E851A, K1082A y D1222A impidieron el crecimiento de la cepa hasta el punto de la cepa FKS1-KO (Fig. 3e). La mutación N1085A ralentizó el crecimiento y la mutación Y849A no tuvo un efecto evidente sobre el crecimiento. En segundo lugar, medimos los niveles de glucano de la pared celular en estas cepas cuando crecían sin FK506. Descubrimos que todas las mutaciones, incluida la cepa FKS1-KO pero excepto la sustitución Y849A, redujeron los niveles generales de glucano en comparación con la cepa WT (Fig. 3f), coincidiendo bien con sus fenotipos de crecimiento (Fig. 3e). Por último, purificamos cada uno de los mutantes de FKS1 (excepto FKS1 (D1222A)) y comparamos su actividad catalítica in vitro (Fig. 3g y Extended Data Fig. 1g). De acuerdo con los fenotipos basados ​​en células descritos anteriormente, las mutaciones E851A, K1082A y N1085A redujeron significativamente la actividad enzimática, mientras que la mutación Y849A solo afectó levemente la actividad. Juntos, los análisis in vivo e in vitro anteriores establecen firmemente la ubicación del sitio activo de FKS1, así como los residuos clave que lo componen.

Un análisis estructural adicional nos permitió identificar residuos adicionales críticos para la catálisis de FKS1. Se sabe que R382 y W383 en el motivo 'QxxRW' en IF2 de BcsA son importantes para la unión al sustrato y la catálisis36. Aunque este motivo falta en FKS1, K1261 y F1258 están ubicados en las posiciones correspondientes en FKS1, como lo hacen R382 y W383 en BcsA (Fig. 3c, d y Extended Data Fig. 5e). En múltiples sintasas unidas a la membrana que contienen el pliegue similar a la celulosa sintasa (BcsA, CesA y HAS), el residuo cargado positivamente correspondiente a BcsA R382 está involucrado en la unión del donante, mientras que el residuo aromático correspondiente a BcsA W383 funciona para estabilizar el aceptor33, 34,36 (Datos ampliados Fig. 6). De hecho, tanto F1258 como K1261 son esenciales para la función de FKS1, como lo demuestran los análisis in vivo e in vitro de sus mutaciones únicas de alanina (Fig. 3e-g). Los análisis anteriores sugieren además que los mecanismos catalíticos centrales entre FKS1 y BcsA están conservados.

Tanto FKS1 como BcsA son polisacáridos sintasas procesivas y su producto polimerizado, los glucanos, necesitan translocarse a través de las membranas1,38. De acuerdo con esto, justo debajo del sitio activo, FKS1 tiene un bolsillo formado dentro de la membrana (Fig. 3a). Está revestido por TM5–8, TM11–12 e IF1 (Fig. 4a). TM5–8 y TM11–12 de FKS1 son parte del núcleo plegable similar a la celulosa sintasa y corresponden a TM3–8 que forman la ruta de translocación de celulosa en BcsA36 (Fig. 2j, k). En el lado extracelular opuesto a este bolsillo, existe otro bolsillo expuesto al solvente con una densidad de detergente mucho más baja que es directamente visible desde el mapa EM (Fig. 4b). El segundo bolsillo se forma porque los TM9-10 y TM12 expuestos a la membrana son cortos. Los dos bolsillos hidrofílicos yuxtapuestos con el plano de la membrana conducen a un notable adelgazamiento de la membrana (Fig. 4a, b), lo que podría reducir en gran medida la barrera de energía para la translocación de glucano a través de las membranas, como se ha propuesto para varias translocasas de membrana39. De hecho, las mutaciones de residuos a lo largo de este camino en FKS1 alteraron la función de FKS1 (Fig. 4c, d). Por ejemplo, dos residuos conservados (F1297 y H1298) se ubican entre el sitio activo y la entrada citosólica. Sus sustituciones de alanina afectaron la función de FKS1, lo que sugiere que pueden estar involucrados en la guía de glucano. Por el contrario, al sustituir dos residuos aromáticos voluminosos conservados que sellan la salida extracelular (F1311 y F1475) con alanina, las cepas mutantes crecieron más rápido que la cepa WT. Pudimos purificar FKS1 (F1475A) y exhibió una mayor actividad catalítica in vitro y una sensibilidad reducida al inhibidor de FKS1 caspofungina (Fig. 4d), lo que implica el agrandamiento de F1475A en la salida de glucano.

a, Vía de translocación putativa de glucano a través de dos bolsillos de membrana como se ilustra en la matriz hexagonal. El primer bolsillo (en la vista de la superficie interna sombreada), bordeado por TM5-12, se encuentra debajo del sitio activo (óvalo verde discontinuo). Se etiquetan los residuos conservados implicados en guiar la entrada (H1298 y F1297) y sellar la salida (F1311 y F1475). En el lado extracelular, se forma un segundo bolsillo porque los TM9–10 y TM12 expuestos a la membrana son demasiado cortos (menos de 28 Å) para abarcar toda la membrana. b, El mapa de densidad EM sin agudizar muestra la depresión del detergente cerca de la ruta de translocación de glucano. Este camino está marcado por el cuadro blanco discontinuo, con las flechas que indican la supuesta entrada y salida. La densidad del detergente está en gris. El espesor estimado de la membrana está etiquetado. El recuadro muestra la vista extracelular de la región encuadrada con la línea naranja. c, Ensayo funcional in vivo de FKS1 con mutaciones seleccionadas alrededor de la ruta de translocación de glucano. El crecimiento de las cepas indicadas durante 48 h se analizó sin (izquierda) y con (derecha) el inhibidor FK506 específico de FKS2. d, actividades in vitro de FKS1 de WT y el mutante F1475A purificado con CHAPS, con o sin el inhibidor de FKS1 CFN. Las actividades se normalizaron a la cantidad de proteína. Los datos son media ± sem; n = 3 experimentos independientes. e, la estructura de FKS1 (S643P) muestra una densidad alargada (malla azul) en el primer bolsillo de la membrana (como se muestra en a) para la translocación del producto. Esta estructura se determinó en presencia de UDP-Glc para sintetizar el producto, que se potenció con CFN. Las hélices TM se indican con números. El recuadro muestra la vista ampliada de una cadena de glucano modelada de 4-glucosa (barra amarilla) superpuesta con su densidad correspondiente (malla azul). f, Residuos potenciales involucrados en la interacción de glucano.

A continuación, determinamos la estructura del mutante hiperactivo FKS1 (S643P) purificado por GDN cuando se incuba con UDP-Glc y caspofungina, a una resolución de 3,5 Å (Datos ampliados, Fig. 7), con la esperanza de capturar el sustrato unido o unido al producto. estado de la enzima. Aunque la estructura de FKS1 (S643P) no muestra grandes diferencias conformacionales con respecto a la de WT FKS1 (desviación cuadrática media de aproximadamente 0,7 Å), notamos una densidad alargada a lo largo del canal de translocación del producto propuesto, presumiblemente correspondiente a un límite producto (Fig. 4e). Modelamos una cadena de glucano de 4-glucosa en esta densidad (Fig. 4e, recuadro). Una serie de residuos hidrofílicos e hidrofóbicos de FKS1 se alinean a lo largo de la cadena de glucano modelada para interacciones favorables enzima-producto (Fig. 4f). El canal de translocación permanece cerrado en el lado extracelular, lo que sugiere la existencia de un mecanismo de apertura del canal regulado, como se ha propuesto recientemente para HAS34.

Primero evaluamos nuestro sistema de ensayo basado en S. cerevisiae para el análisis de la resistencia a las equinocandinas. Seleccionamos dos mutaciones observadas con mayor frecuencia en C. albicans resistente a fármacos (CaFKS1 F641S y S645P)28 y las introdujimos en los sitios correspondientes de S. cerevisiae FKS1 (ScFKS1 F639S y S643P). Ambas cepas mutantes exhibieron una resistencia muy elevada a la caspofungina (Datos ampliados, Fig. 8a). Purificamos aún más estos dos ScFKS1 mutados en CHAPS y evaluamos su inhibición por caspofungina (Fig. 5a). El WT ScFKS1 como control exhibió un perfil inhibidor típico, con una IC50 determinada en 0,55 µM, que es comparable con la determinada previamente con diferentes métodos23,25. Por el contrario, tanto ScFKS1(F639S) como ScFKS1(S643P) son insensibles a la inhibición por caspofungina.

a, perfiles de inhibición de CFN de variantes de FKS1 purificadas con CHAPS, incluido WT FKS1 y dos mutaciones resistentes a equinocandina observadas con mayor frecuencia: F639S y S643P. Se muestra el porcentaje de actividad residual. Los datos son media ± sem; n = 3 experimentos independientes. b, Tres regiones de puntos críticos (rojas; indicadas como HS1–3) con mutaciones resistentes a las equinocandinas se mapean en la estructura FKS1. Las regiones del punto de acceso están localizadas en un grupo de tres hélices TM vecinas: TM5, TM8 y TM6, respectivamente. El pliegue similar a la celulosa sintasa conservado dentro de FKS1 se resalta en la representación de dibujos animados, mientras que la parte restante está en la representación de la cinta. Este pliegue conservado está rodeado por lípidos ordenados que se muestran como barras amarillas. La línea discontinua indica región desordenada. c, Vista de primer plano de las mutaciones resistentes a las equinocandinas como se describe en b. También se muestra un sitio de mutación resistente a ibrexafungerp (A1369) fuera de estas regiones de puntos críticos. Los átomos de Cα de las mutaciones se indican como esferas rojas. Las regiones de puntos críticos están enriquecidas con lípidos ordenados, con densidades de lípidos seleccionadas que se muestran en una malla gris. d, cambios conformacionales y arreglos de lípidos (indicados por flechas rojas) alrededor de la región HS1 debido a la introducción de FKS1 (S643P), la mutación resistente a los medicamentos. Esto se ilustra con la superposición de la estructura FKS1 (gris) y la estructura FKS1 (S643P) (azul). La línea discontinua negra indica una posible interacción polar.

A continuación, investigamos la posible base mecánica de la resistencia a las equinocandinas utilizando la estructura FKS1. Según sus ubicaciones, las mutaciones resistentes a las equinocandinas se clasificaron en tres regiones conservadas, que abarcan los residuos 639–647 en TM5 (punto crítico 1), 1354–1357 en TM8 (punto crítico 2) y 690–700 en TM6 (punto crítico 3) (los residuos son numerado como en ScFKS1) 20,22,40 (Fig. 2 complementaria). Aunque separados en la secuencia primaria, tres puntos críticos de mutación están espacialmente cerca uno del otro (Fig. 5b, c). En aislamientos de C. glabrata resistentes a ibrexafungerp, se informaron nuevos sitios de mutación fuera de los hotspots 1 y 2 de FKS2 (por ejemplo, CgFKS2 W715L y A1390D)41; estos sitios de mutación corresponden a W695 en el punto de acceso 3 de ScFKS1 y A1369 en TM8 adyacente al punto de acceso 3, respectivamente (Fig. 5c). Este análisis sugiere superposición de sitios de unión a FKS entre equinocandina e ibrexafungerp41. Estas regiones de puntos críticos resistentes a los medicamentos parecen estar estrechamente relacionadas con el entorno de la membrana. Todas las mutaciones resistentes a la equinocandina de FKS1 se mapean cerca de la superficie hidrofóbica convexa formada por TM5–6 y TM8 y están específicamente rodeadas por varias moléculas de lípidos ordenadas (Figs. 2c y 5c). F639 y S643 de la región del punto de acceso 1 están involucrados en la unión de lípidos; la cadena lateral de F639 interactúa directamente con tres moléculas de lípidos y la cadena lateral de S643 parece fijar la cadena principal del residuo Y638 que interactúa con los lípidos (Fig. 5d). Además, analizamos la estructura de FKS1 (S643P) (Datos extendidos Fig. 7), centrándonos en las alteraciones de la unión a lípidos inducida por la mutación (Fig. 5d). Varios residuos del hotspot 1 cerca de los lípidos enriquecidos muestran una conformación alterada; Y638 tiene su cadena lateral girada aproximadamente 90°, con la cadena lateral F639 girando en la misma dirección. Sorprendentemente, estos cambios conducen a desplazamientos de los lípidos unidos cercanos, lo que sugiere que la mutación S643P resultó en un entorno lipídico alterado.

Sobre la base de nuestros resultados, proponemos dos posibles mecanismos resistentes a los medicamentos para FKS1. En primer lugar, dado que los fármacos de tipo equinocandina son lipopéptidos con colas de lípidos configuradas de manera diferente19 (Datos ampliados, Fig. 8b,c), el patrón de agrupación de las mutaciones resistentes a las equinocandinas sugiere un posible sitio de unión para estos fármacos, y las uniones pueden implicar sus lípidos. colas (Fig. 5b,c). Por tanto, la resistencia al fármaco puede atribuirse a alteraciones del sitio de unión al fármaco que resultaron de las mutaciones. En segundo lugar, considerando los lípidos ordenados enriquecidos cerca de las regiones de puntos críticos resistentes a los medicamentos y los movimientos de lípidos revelados a partir de la estructura de FKS1 (S643P) (Fig. 5c, d), es concebible que las mutaciones resistentes a los medicamentos puedan alterar la respuesta de FKS1 a Cambios en la membrana causados ​​por la equinocandina. Tal mecanismo ha sido propuesto para los antibióticos daptomicina y polimixinas, que también son fármacos lipopeptídicos y de membrana42,43. De manera consistente, se ha informado que microdominios de membrana específicos están asociados con la síntesis de β-1,3-glucano44,45. Además, se ha demostrado que los cambios en el microambiente lipídico se correlacionan con la acción de la equinocandina sobre FKS46,47.

Nuestro trabajo revela la arquitectura molecular de la glucano sintasa fúngica FKS1. Las estructuras de FKS1, junto con extensas caracterizaciones funcionales, mejoran nuestra comprensión mecánica de la síntesis de β-1,3-glucano de la pared celular fúngica. El análisis basado en la estructura de las mutaciones resistentes a las equinocandinas y la estructura del mutante S643P sugieren un mecanismo plausible de resistencia a los fármacos de las mutaciones FKS1. Estos conocimientos también pueden ser compartidos por varios patógenos fúngicos, ya que sus ortólogos de FKS están altamente conservados (Datos extendidos Fig. 9 y Fig. 2 complementaria). Las estructuras de FKS1 y el mecanismo catalítico dilucidado en este trabajo pueden servir como marco para futuros estudios de este importante objetivo de fármaco antifúngico, así como para la detección y el desarrollo de nuevos agentes antifúngicos.

Se diseñó una etiqueta Flag 3x en el extremo C del cromosoma FKS1 en la cepa BY4742 de S. cerevisiae, utilizando un método de etiquetado basado en PCR48. Se generó una cepa de levadura con la mutación cromosómica FKS1(S643P) utilizando el método de recombinación homóloga49. Para el análisis crio-EM y la síntesis del producto, FKS1 y el mutante FKS1 (S643P) se purificaron con detergente GDN como se describe a continuación. Las cepas se cultivaron en medio YPD a 30 °C durante 20 h. Las células se recogieron por centrifugación y se lisaron con prensa francesa en tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM y MgCl2 2 mM suplementado con fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) 1 mM. El lisado se centrifugó a 15.000 g durante 30 min. El sobrenadante se sometió a ultracentrifugación a 100.000 g durante 1 h. El sedimento de membrana recogido se solubilizó en tampón Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 500 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 10 % (v/v), n-dodecil-β-d-maltopiranósido al 1,5 % (p/v) ( DDM; Anatrace), sal tris de hemisuccinato de colesterilo al 0,15 % (CHS; Anatrace) e inhibidor de proteasa (cóctel completo de inhibidor de proteasa; Roche) mediante agitación suave durante 2 h. El sobrenadante se recogió mediante centrifugación a 15.000 g durante 0,5 h y se aplicó a gel de afinidad Anti-Flag M2 (Sigma). A continuación, el gel se lavó con tampón de lavado que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM y GDN al 0,04 % (Anatrace). Las proteínas diana se eluyeron con tampón de lavado suplementado con 150 μg ml−1 de péptido Flag 3X. El eluato se concentró y se purificó más mediante cromatografía de exclusión por tamaño (columna Superose 6 10/300 GL, GE Healthcare) con tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM y GDN al 0,04 % (Anatrace). Las fracciones centrales del pico monodisperso se recolectaron y concentraron para la preparación de la rejilla crio-EM y la síntesis del producto.

La construcción del vector de S. cerevisiae Rho1 N-terminal 6x His-SUMO-tagged se transformó en Escherichia coli BL21 (DE3). Las cepas se cultivaron en medio LB suplementado con 100 µg ml-1 de ampicilina a 37 °C hasta que la DO600 alcanzó aproximadamente 0,6. La expresión de proteínas se indujo con isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido 0,5 mM a 18 °C durante 20 h. Las bacterias recogidas se resuspendieron y lisaron mediante French Press en tampón A que contenía Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 300 mM y MgCl2 2 mM. Después de la centrifugación, la proteína se purificó del sobrenadante mediante cromatografía de afinidad de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA). Al dializar en el tampón A, se añadió 6x proteasa Ulp1 etiquetada con His en una proporción de 1:200 Ulp1:Rho1 (p/p) para eliminar la etiqueta 6x His-SUMO. La etiqueta 6X His-SUMO escindida y la proteasa se eliminaron mediante otra ejecución de cromatografía de afinidad Ni-NTA, y el flujo continuo se recogió, se concentró y se sometió a una cromatografía de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) en tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM y MgCl2 2 mM. Las fracciones centrales del pico monodisperso a 15,6 ml se recogieron y concentraron a 10 mg ml−1.

Para el análisis crio-EM de una sola partícula, se aplicó una alícuota de 3 µl del FKS1 purificado a una concentración de 5 mg ml−1 a rejillas de carbón Quantifoil descargadas luminiscentes (R1.2/1.3 Au, malla 300). Las rejillas se secaron durante 4 s al 100 % de humedad y se congelaron rápidamente en etano líquido usando FEI Vitrobot IV. Para la muestra de FKS1(S643P) incubada con UDP-Glc, se mezcló FKS1(S643P) purificada en GDN (7 mg ml−1) con UDP-Glc (0,5 mM), suplementada con 0,7 mg ml−1 de Rho1, GTPγS 10 μM , caspofungina 200 µM, CHAPS al 0,1 % y CHS al 0,02 %. La mezcla se incubó a 16 °C durante 2 h antes de congelar las rejillas crio-EM. Los datos de Cryo-EM se recopilaron en un microscopio electrónico FEI Titan Krios operado a 300 kV equipado con una cámara Gatan K3 Summit colocada después de un filtro de energía cuántica GIF. La adquisición de datos automatizada se realizó con SerialEM o FEI EPU. Las micrografías se registraron en modo de recuento de superresolución con un aumento nominal de ×130 000, en un tamaño de píxel físico de 0,92 Å por píxel. Los valores de desenfoque oscilaron entre -1,2 μm y -3 μm. Se fraccionó la dosis de una exposición total de 1,3 s en 32 fotogramas, lo que resultó en una dosis total acumulada de 50 e− por Å2.

Las películas fraccionadas por dosis grabadas primero se alinearon y ponderaron por dosis con MotionCor2 (ref. 50). Luego se usó CTFFIND4 para determinar los parámetros de la función de transferencia de contraste para micrografías individuales51. Las micrografías de baja calidad reveladas por inspección manual se excluyeron del análisis posterior. Los pasos posteriores de procesamiento de imágenes se realizaron utilizando RELION-3 (ref. 52).

Para el conjunto de datos FKS1, se seleccionó manualmente un conjunto de 2000 partículas para generar plantillas de clase 2D para la selección automática de partículas basada en referencias. La selección automática arrojó 2.321.905 partículas de 11.606 micrografías. Se realizaron dos rondas de clasificación 2D sin referencia para eliminar partículas de mala calidad, lo que resultó en un conjunto limpio de 1 335 014 partículas. Se generó un mapa ab initio con RELION y se utilizó como modelo de referencia inicial para una clasificación 3D adicional. Después de tres rondas de clasificación 3D, se seleccionó una clase 3D con características de alta resolución (267 574 partículas). El posterior pulido de partículas, el refinamiento 3D y el posprocesamiento generaron un mapa con una resolución general de 3,4 Å.

Para el conjunto de datos FKS1 (S643P), se seleccionó manualmente un conjunto de aproximadamente 2000 partículas para generar plantillas de clase 2D para la selección automática de partículas basada en referencias. La recogida automática arrojó 2.222.315 partículas de 9.623 micrografías. Se realizaron dos rondas de clasificación 2D sin referencia para eliminar partículas de mala calidad, lo que resultó en un conjunto limpio de 1 620 308 partículas. El modelo FKS1 se utilizó como modelo de referencia inicial para una clasificación 3D adicional. Se seleccionó una clase 3D con características de alta resolución (690.251 partículas). El posterior pulido de partículas, el refinamiento 3D y el posprocesamiento generaron un mapa con una resolución general de 3,6 Å. Esta reconstrucción reveló la densidad de fragmentos dentro del canal de translocación del producto, lo que indica un estado mixto con o sin producto unido. Por lo tanto, realizamos una ronda adicional de clasificación 3D enfocada sin realineación de partículas, utilizando una máscara enfocada alrededor de TM7-12 y el sitio activo que rodea el canal de translocación. Se seleccionó una clase 3D con las características de mayor resolución (176.682 partículas). Las partículas seleccionadas se volvieron a extraer para el refinamiento 3D con máscara completa y el posterior procesamiento posterior. Esto generó un mapa con una resolución general de 3,5 Å, que se utilizó para construir el modelo FKS1 (S643P).

Las resoluciones generales se estimaron con base en el criterio estándar de oro de correlación de la capa de Fourier de 0,14353. La distribución de la resolución local se estimó utilizando ResMap54.

Se generó un modelo inicial aproximado de FKS1 de novo utilizando el módulo map_to_model en PHENIX55. Se mejoró aún más con los ajustes manuales y la reconstrucción con Coot56, lo que se vio facilitado por las buenas densidades alrededor de las hélices TM y las densidades voluminosas alrededor de residuos como Trp, Tyr, Phe y Arg. El refinamiento del modelo FKS1 contra el mapa crio-EM en el espacio real se llevó a cabo en PHENIX con restricciones de estructura y geometría secundarias55. En el modelo final de FKS1, hay varias regiones no estructuradas, incluidos 145 residuos N-terminal, 16 residuos C-terminal, seis segmentos flexibles del dominio citoplasmático (residuos 244–278, 475–487, 798–805, 897–931, 1159 –1167 y 1247–1266) y cuatro segmentos de bucle para conectar hélices TM (residuos 1419–1435, 1516–1554, 1627–1637 y 1698–1723). El modelo de FKS1 (S643P) se construyó en base al modelo de FKS1. Se utilizó MOLPROBITY para evaluar el modelo final57. La correlación de capa de Fourier entre el modelo y el mapa fue calculada por PHENIX.mtriage58. La búsqueda de estructuras homólogas se realizó mediante el servidor DALI59. Para la comparación estructural con FKS1, se utilizó la estructura modelada AlphaFold de curdlan sintasa60,61. Las figuras ilustradas se prepararon utilizando PyMOL (Schrödinger, LLC), Chimera y ChimeraX62,63. Las estadísticas de las reconstrucciones 3D y los refinamientos del modelo se muestran en la Tabla de datos ampliados 1.

Las cepas de levadura con mutaciones cromosómicas FKS1 y la cepa FKS1-KO se generaron utilizando el método de recombinación homóloga49. Los mutantes se seleccionaron en SD-His (Medio de abandono sintético de levadura sin histidina, nº de cat. S0020, Solarbio) y se confirmaron mediante PCR genómica y secuenciación de ADN. Para el análisis del fenotipo de crecimiento, el ensayo de crecimiento puntual de cepas mutadas se adaptó de un método descrito previamente24. Las cepas se cultivaron en medio YPD a 30 °C a 200 rpm a fase exponencial hasta que la DO600 fue de 0,8. Las células se diluyeron a una DO600 de 0,1. Luego, porciones de 5 μl de diluciones diez veces mayores de las cepas indicadas se colocaron en SD-His con o sin FK506 (1 μg ml−1). Después de la incubación a 30 °C durante el tiempo indicado, las placas se fotografiaron con el 5200CE Image System (TANON). Cada ensayo se repitió tres veces con resultados similares.

Para perfilar el crecimiento celular, la cepa WT y la cepa FKS1-KO se cultivaron en medio YPD a 30 °C durante la noche hasta la fase exponencial. Luego, las células cultivadas se inocularon en medio YPD fresco con una DO600 inicial de 0,01, que se complementó con o sin 1 μg ml−1 de FK506. A continuación, los nuevos cultivos se cultivaron a 30 °C hasta la fase estacionaria. Durante el cultivo, se midieron las densidades ópticas (OD600) a intervalos de 8 h durante 48 h. Los experimentos se realizaron por triplicado para realizar las curvas de crecimiento celular.

Las cepas de levadura que portaban diferentes variantes de FKS1 con la etiqueta Flag 3x C-terminal se generaron, cultivaron y lisaron como se describe anteriormente. La membrana recolectada se solubilizó en tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 7,4, EDTA 1 mM, glicerol al 33 %, CHAPS al 0,5 % (Anatrace), CHS al 0,1 % (Anatrace), GTPγS 4 µM e inhibidor de proteasa (cóctel de inhibidor de proteasa cOmplete, Roche). FKS1 y sus variantes se purificaron usando gel de afinidad anti-Flag M2 (Sigma) y se eluyeron en tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 7,4, EDTA 1 mM, 33 % de glicerol, 0,2 % de CHAPS y 0,04 % de CHS, complementado con 150 μg ml−1 3× Péptido bandera. Las proteínas purificadas en detergente CHAPS o GDN se analizaron utilizando el kit de ensayo de glicosiltransferasa UDP-Glo ​​(Promega) para controlar la liberación de UDP. De las variantes de FKS, se agregaron 2,5 µl a 30 µl de mezcla de reacción en total que contenía Tris-HCl 50 mM pH 7,4, glicerol al 33 %, EDTA 1 mM, 6 µg ml−1 Rho1, CHAPS al 0,2 %, CHS al 0,04 %, GTPγS 4 µM y fluoruro de potasio (KF) 20 mM. La reacción se inició añadiendo UDP-Glc hasta una concentración final de 2,5 mM. La reacción se llevó a cabo a 30 °C durante 1 h. La luminiscencia se registró usando un sistema Pherastar FS (BMG Labtech). La actividad final se normalizó a la cantidad de FKS1 que se midió mediante inmunotransferencia frente a la etiqueta 3x Flag, usando el anticuerpo monoclonal etiqueta DYKDDDDK (dilución 1:1000; n.º de cat. 66008-3-Ig, clon n.º 2B3C4, Proteintech). En el caso del perfil de inhibidores, primero se incubaron diluciones en serie de fármacos de equinocandina con variantes de FKS1 durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de agregar otros componentes para que reaccionaran.

Para la síntesis in vitro de β-1,3-glucano, la enzima purificada en detergente GDN (FKS1 o el mutante FKS1(S643P); 0,02 mg ml−1) y el donante UDP-Glc (2,5 mM) se mezclaron en tampón de reacción (50 Tris-HCl mM pH 7,4, glicerol al 33 %, EDTA 1 mM, Rho1 6 μg ml−1, CHAPS al 0,2 %, CHS al 0,04 %, GTPγS 4 μM y KF 20 mM), en presencia o ausencia de caspofungina 200 μM. El volumen de reacción se estableció en 100 μl (para la tinción con azul de anilina) o 10 ml (para el enriquecimiento del producto y la subsiguiente degradación enzimática y análisis de enlace de glucosilo). La reacción se llevó a cabo a 30 °C durante el período de tiempo indicado.

Para la tinción de los productos sintetizados con azul de anilina se tomó una alícuota de 100 μl de reactivos o 0,1% (p/v) de β-glucano de S. cerevisiae (Sigma) y se añadió a igual volumen de azul de anilina (0,03%; Sigma ). La mezcla se incubó en la oscuridad durante 20 min para completar la unión del colorante. Luego, cada muestra se cargó en un capilar y se observó bajo un microscopio de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 365 nm y una longitud de onda de emisión de 433 nm. Cada ensayo se repitió tres veces con resultados similares.

El polímero sintetizado in vitro es insoluble en agua y se recogió por centrifugación. Se lavó dos veces con tampón: Tris-HCl 50 mM pH 7,4, glicerol al 33 %, EDTA 1 mM, CHAPS al 0,2 %, CHS al 0,04 %, KF 20 mM y dos veces con agua desionizada. Para el análisis de degradación del polímero sintetizado se utilizaron dos enzimas: endo-β-1,3-glucanasa (Trichoderma sp.; código de producto: E-LAMSE, Megazyme) o endo-β-1,4-glucanasa (Aspergillus niger; código de producto: E-CELAN, Megazyme). Estas dos enzimas se dializaron primero en el tampón (NaAc 100 mM, pH 4,5). A continuación, se añadieron 0,5 U de cada enzima a 50 µl al 1 % (p/v) del polímero sintetizado en NaAc 200 mM (pH 4,5). La degradación de controles estándar de celulosa (C6288, Sigma) o curdlan (C7821, Sigma) también se realizó con la misma condición64,65. Las mezclas se incubaron a 40 °C, y las muestras se retiraron a varios intervalos de tiempo y se hirvieron durante 5 min para terminar la reacción. A continuación, los productos de degradación enzimática se analizaron mediante cromatografía en capa fina. En resumen, se colocó una alícuota de 2 µl de las muestras extraídas en una placa de gel de sílice (Merck Silica gel 60 F254) y se reveló en un sistema solvente que contenía n-butanol:ácido acético:agua (2:1:1 v/v/ v). Las placas se visualizaron sumergiéndolas en metanol:ácido sulfúrico (95:5 v/v) y posterior calentamiento a 95 °C. Se usó una mezcla de glucosa (G5767, Sigma), laminaribiosa (O-LAM2, Megazyme), laminaritriosa (O-LAM3, Megazyme) y laminarihexaosa (O-LAM6, Megazyme) como patrones de cromatografía en capa fina.

Durante la digestión enzimática del polímero sintetizado, los azúcares reductores liberados se midieron utilizando los reactivos DNS (Micro Reducing Sugar Assay Kit, Abbkine). En resumen, se mezclaron 175 μl de la muestra de hidrólisis diluida con 125 μl de reactivo DNS. Se utilizó el estándar del kit en el rango de concentración de 0,2 a 0,6 mg ml−1 para generar la curva estándar. Las mezclas de reacción se hirvieron en un baño de agua durante 5 min. Después de enfriar a temperatura ambiente en un baño de agua helada, se midió la absorbancia de una muestra de 0,2 ml a 540 nm.

El polímero sintetizado in vitro por FKS1 se lavó dos veces con tampón: Tris-HCl 50 mM pH 7,4, glicerol al 33 %, EDTA 1 mM, CHAPS al 0,2 %, CHS al 0,04 %, KF 20 mM y dos veces con agua desionizada. A continuación, la muestra lavada se dializó en agua desionizada y se liofilizó. El análisis de metilación se realizó siguiendo un estudio previo66. La muestra seca (aproximadamente 1 mg) se disolvió en DMSO (500 μl). La metilación se realizó en DMSO/NaOH con yodometano durante 1 h. Los productos metilados se hidrolizaron con ácido trifluoroacético 2 M a 121 °C durante 90 min, se redujeron con NaBD4 y se acetilaron con anhídrido acético a 100 °C durante 2,5 h. Los acetatos de alditol parcialmente metilados resultantes se analizaron mediante el sistema GC-MS (6890A-5975C, Agilent Technology) equipado con una columna cromatográfica Agilent BPX70 (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm; SGE). El programa de temperatura se fijó de la siguiente manera: 140 °C durante 2 min, 140–230 °C a 3 °C por minuto y 230 °C durante 3 min.

Los niveles de β-1,3-glucano se determinaron mediante el ensayo de azul de anilina, como se describió previamente23,26,67,68,69,70,71,72. Las cepas de prueba se cultivaron en medio YPD hasta la fase exponencial hasta que la DO600 fue de 0,5. Se recogió la misma cantidad de células para cada cepa mediante centrifugación a 5.000 g. Las células recogidas se lavaron dos veces con tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 y EDTA 1 mM). Las células sedimentadas se suspendieron con 0,5 ml de tampón TE y se mezclaron con 0,1 ml de NaOH 6 M. La mezcla se incubó en un baño de agua a 80 °C durante 30 min para solubilizar el glucano. A continuación, se añadieron a cada muestra 2,1 ml de azul de anilina (azul de anilina al 0,03 %, HCl 0,18 M y glicina-NaOH 0,49 M, pH 9,5). Las muestras se agitaron brevemente en vórtex y se incubaron a 50 °C durante 30 min y 30 min adicionales a 24 °C. La fluorescencia se cuantificó usando un lector de placas de fluorescencia (CLARIOstar Plus, BMG Labtech) bajo una longitud de onda de excitación de 400 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm con un corte de 455 nm. Todas las muestras se midieron por triplicado.

Las muestras de proteínas se separaron con gel SDS-PAGE y se tiñeron con Coomassie. La banda de gel se cortó manualmente y se destiñó. Las proteínas se redujeron con DTT, se alquilaron con IAA y se digirieron con tripsina de grado proteómico en bicarbonato de amonio 20 mM73. La digestión se realizó durante la noche a 37 °C y se detuvo agregando ácido fórmico al 2%. Los péptidos en gel se extrajeron utilizando una solución que contenía ácido fórmico al 2 % y acetonitrilo al 67 %. Los péptidos se secaron al vacío, se resuspendieron en ácido fórmico al 0,1 %, se cargaron en la columna trampa nanoViper C18 (3 μm, 100 Å) y se separaron en una columna analítica (Acclaim PepMap RSLC, 75 μm × 25 cm; C18 2 μm, 100 Å). Å) usando el sistema EASY nLC 1200 HPLC (Thermo Fisher). El gradiente de elución fue de 5 a 38 % de tampón A (0,1 % de ácido fórmico y 80 % de acetonitrilo) durante 30 min. El análisis de espectrometría de masas se realizó en un espectrómetro de masas Q Exactive (Thermo Fisher). Los datos resultantes se convirtieron a un archivo mgf con ProteoWizard y se analizaron utilizando el motor de búsqueda Mascot para la identificación de proteínas en una base de datos UniProt Saccharomyces cerevisiae con una tasa de descubrimiento falso de menos del 1 %.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los mapas de densidad EM se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica con los códigos de acceso EMD-33154 (FKS1) y EMD-34115 (FKS1(S643P)). Las coordenadas se han depositado en el PDB con los códigos de acceso 7XE4 (FKS1) y 7YUY (FKS1(S643P)). Este estudio analizó varias estructuras de proteínas disponibles públicamente en PDB con los códigos de acceso 4HG6, 6WLB, 7SP7, 6YV8, 6iwr, 6h4m y 1qgq.

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Agradecemos a todos los miembros del personal del Centro Cryo-EM de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur por su ayuda en la recopilación de datos; y J. Zhao por su asesoramiento sobre cromatografía en capa fina. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (92053112 y 31971148 para HY, 32100575 para Min Zhang y 82188101 para Mingjie Zhang), el Programa de Talento de ShenZhen KQTD20210811090115021 (para Mingjie Zhang y XL), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (5003510056 a HY y 5003510112 a Min Zhang) y Programa del Equipo Juvenil de la Frontera Académica HUST (2018QYTD02 a HY).

Estos autores contribuyeron igualmente: Xinlin Hu, Ping Yang

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina Básica, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Wuhan, China

Xinlin Hu, Ping Yang, Changdong Chai, Jia Liu, Huanhuan Sun, Yanan Wu, Min Zhang y Hongjun Yu

Departamento de Biología de Patógenos, Facultad de Medicina Básica, Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Wuhan, China

Xinlin Hu, Jia Liu y Min Zhang

Escuela de Ciencias de la Vida, Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur, Shenzhen, China

Mingjie Zhang y Xiaotian Liu

Greater Bay Biomedical Innocenter, Laboratorio de la Bahía de Shenzhen, Shenzhen, China

Mingjie Zhang

Centro de Investigación de Arquitectura Celular, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Wuhan, China

Hongjun yu

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XH, PY, Min Zhang, XL y HY prepararon la muestra, recopilaron los datos y resolvieron las estructuras. XH, PY y Min Zhang realizaron los experimentos funcionales, asistidos por CC, JL, HS y YW Mingjie Zhang, Min Zhang, XL y HY diseñaron los experimentos, analizaron los datos y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Min Zhang, Xiaotian Liu o Hongjun Yu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Vincent Bulone y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Perfil de elución de cromatografía de filtración en gel (Superose 6 Incremento 10/300 GL) de FKS1 purificado en detergente GDN. El cuadro discontinuo verde marca las fracciones agrupadas para el análisis cryoEM. b, análisis SDS-PAGE (izquierda) y western blot (derecha) de las fracciones del pico de elución monodisperso en (a). Se muestran imágenes representativas de gel y transferencia Western entre 3 réplicas. c, Perfil de elución de cromatografía de filtración en gel (Superose 6 Incremento 10/300 GL) de FKS1 S643 purificado en detergente GDN. El cuadro verde discontinuo marca las fracciones agrupadas para el análisis cryoEM y la síntesis del producto. d, análisis SDS-PAGE de las fracciones del pico de elución monodisperso en (c). Se muestra un gel representativo entre 3 réplicas. e, Perfil de elución de cromatografía de filtración en gel (Superdex 200 Incremento 10/300 GL) de Rho1. El cuadro verde discontinuo marca las fracciones agrupadas para el ensayo de actividad y la síntesis del producto. f, análisis SDS-PAGE de las fracciones del pico de elución monodisperso en (e). Dos picos en (e) muestran un patrón similar de tres bandas (f), y las tres bandas se identificaron como Rho1 mediante análisis de espectrometría de masas. Se muestra un gel representativo entre 3 réplicas. g, análisis de transferencia Western de FKS1 de tipo salvaje y diferentes variantes de FKS1 purificadas en detergente CHAPS. Se muestra una imagen representativa entre 3 réplicas. h, análisis SDS-PAGE de variantes de FKS1 marcadas con bandera purificadas por GDN, que se usaron para los ensayos de actividad (ij) y síntesis de productos (k). Primer carril, FKS1 WT; segundo carril, FKS1 S643P (el mutante resistente a la equinocandina); tercer carril, FKS1 S643P purificado está inmunodepletado por perlas anti-bandera; cuarto carril, FKS1 S643P/K1261A. Se muestra un gel representativo entre 3 réplicas. Para (b, d, f, g, h), sus escaneos completos se proporcionan en la Fig. 1 complementaria. i, Actividad in vitro de las variantes de FKS1 purificadas en GDN. La actividad se ensayó monitoreando la UDP generada (reacción de 1 hora). Los datos son la media ± SEM, n = 3 experimentos independientes. j–k, Ensayo de síntesis de productos in vitro por variantes de FKS1 purificadas en GDN. El ensayo se realizó mediante la tinción de los productos sintetizados con colorante azul de anilina (j; reacción de 12 h) o mediante la visualización de los productos sintetizados (k; reacción de 48 h). Estos experimentos fueron repetidos tres veces con resultados similares. l, especificidad del donante de la síntesis del producto por FKS1 S643P purificado con GDN. Los polímeros insolubles en agua (indicados por la flecha blanca) aparecen solo en presencia de UDP-Glc en lugar de UDP-GlcNAc. este experimento fue repetido tres veces con resultados similares. m, Los efectos de Mg2+ sobre la actividad catalítica de FKS1 S643P purificado con GDN. La actividad se ensayó en presencia de EDTA 1 mM o Mg2+ 200 μM. Los datos son la media ± SEM, n = 3 experimentos independientes. Recuadro, síntesis del producto en presencia de EDTA 1 mM o Mg2+ 200 μM. este experimento fue repetido tres veces con resultados similares.

a, Cuantificación de los azúcares reductores liberados durante la digestión enzimática del polímero insoluble en agua sintetizado por FKS1 S643P purificado con GDN. Se utilizaron dos glucanasas específicas: endo-1,3-β-glucanasa específica y endo-1,4-β-glucanasa. Los datos son la media ± SEM, n = 3 experimentos independientes. b–c, la especificidad de hidrólisis de la endo-1,3-β-glucanasa y la endo-1,4-β-glucanasa se probó frente al polisacárido estándar β-1,3-glucano curdlan (b) y celulosa (c). Se usó una mezcla de glucosa (G1), laminaribiosa (G2), laminaritriosa (G3) y laminarihexaosa (G6) como patrones (carril M). d, el espectro de masas del pico de GC (11,64 min) en la (Fig. 1f) revela la identidad de este PMAA como 1,3,5-tri-O-acetil-2,4,6-tri-O-metil glucitol, lo que confirma Enlace 1,3-Glcp.

a, Una micrografía crio-EM representativa de FKS1 de 11606 micrografías recopiladas. b, Promedios representativos de clase 2D. c, Diagrama de flujo de adquisición de datos crio-EM y procesamiento de datos de FKS1. Ver Métodos para más detalles. d, la curva de correlación de capa de Fourier estándar de oro (FSC) del mapa reconstruido. e, La curva FSC entre el modelo y el mapa, que se calcula mediante PHENIX.mtriage58. f, Vistas en corte de la distribución angular de todas las partículas utilizadas en la reconstrucción 3D final. g, distribución de resolución local del mapa crio-EM final de FKS1, calculado con ResMap54. h, Diagrama topológico del dominio GT de FKS1. Los segmentos flexibles invisibles en la reconstrucción 3D se representan mediante líneas discontinuas. i, Interacciones entre el dominio AC y GT. Están marcadas las hebras β centrales y los elementos estructurales involucrados en la extensa interfaz de contacto: α2-5, α8-11, bucles Lα9-α10 y Lα11-α12 del dominio AC; α31, α34-35, bucles Lβ5-β6, Lβ7-β8; Lβ8-β9 del dominio GT). El FKS1 R319, un residuo esencial previamente identificado para FKS124, está marcado por su átomo de Cα como esfera y está incrustado en esta interfaz. j, vista ampliada de la región encuadrada en (i), que muestra la interacción entre R319 y N1087 para mantener la interfaz entre el dominio AC y GT.

a, densidades Cryo-EM de TM1-8, 11–17. bc, densidades Cryo-EM de la hoja β central continua de 9 hebras que aparecen en el dominio FKS1 GT. d, densidad Cryo-EM del N-glicano en N1849. e, densidades Cryo-EM del sitio activo. f, Vista en corte de las densidades crio-EM cerca de TM9 y TM10. El mapa está segmentado y coloreado como en la Fig. 2a. Las densidades correspondientes a las hélices TM TM7-12, TM14-16 se indican mediante números. Solo se puede rastrear la cadena principal TM9-10 a partir de este mapa, aunque exhiben densidades más débiles que otras hélices TM. g – h, dos vistas del modelo FKS1 con lípidos unidos. El modelo FKS1 está coloreado como la Fig. 1h y los lípidos ordenados se muestran como esferas amarillas. Las densidades crio-EM de los lípidos se ilustran en los recuadros discontinuos. La posición y la densidad del fosfolípido incrustado dentro del dominio transmembrana se muestra en el recuadro sólido.

a, El pliegue conservado de FKS1 (residuos 615–1510) se superpuso con el de BcsA (PDB ID: 4P00; residuos 63–584), con un valor RMSD de 4,3 Å sobre 308 residuos alineados. BCsA está coloreado en gris. El núcleo de FKS1 está coloreado en naranja, mientras que los elementos exclusivos de FKS1 en su dominio GT están codificados por colores como se indica en (a) y (b). Las hélices TM correspondientes se indican como etiquetas, mientras que TM9 y TM10 son exclusivas para FKS1. b, Vista de primer plano de los dominios GT superpuestos en (a). La hoja β central que aparece en el dominio GT gana extensión en FKS1. Los soportes extendidos β6 y β7 en FKS1 y el bucle alargado Lβ8-β9 contribuyen a una parte sustancial de la interfaz de interacción con el dominio AC en FKS1 (Fig. 1j). Además, dos subregiones específicas de FKS1 se insertan en dos lados de β3, la primera hebra de la lámina β central. La subregión que precede a β3 (residuos 719–840) contiene seis hélices y un par de hebras β antiparalelas (β1, β2); la subregión resultante de β3 (residuos 848–998) es α-helicoidal, compuesta por 9 hélices. Estas dos subregiones interactúan para empaquetar la hoja β central desde un lado. c, Vista posterior de los dominios transmembrana superpuestos. d, Vista de primer plano de las interfaces membrana-citosol superpuestas. La hélice de interfaz IF1 se conserva en FKS1, que muestra una reorganización dramática en relación con la de BcsA. La interfaz de hélice IF2 que conecta una hoja beta y un dominio transmembrana se conserva en FKS1 pero está desordenada en la estructura, que también se indica en (c). La interfaz hélice IF3 desaparece en FKS1 y se reemplaza por hélices transmembrana TM9 y TM10 en FKS1. e, Alineación de secuencia basada en la estructura de los pliegues similares a la celulosa sintasa conservados entre FKS1 y BcsA. La alineación se generó primero con PROMALS3D y luego se ilustró con el servidor ESPript3. Los residuos y motivos con funciones importantes están etiquetados. Arriba y debajo de la alineación se muestran elementos estructurales secundarios derivados de la estructura FKS1 (símbolo azul) y la estructura BcsA (ID de PDB: 4P00) (símbolo naranja), respectivamente. Los símbolos son hélices TM (barra llena), hélices (barra vacía) y hebras β (flecha).

Los dominios catalíticos de GT analizados se superponen y se muestran por separado como dibujos animados. Los residuos implicados en la unión o catálisis del sustrato se indican como barras. El nucleótido unido se muestra como barras finas de color magenta. Los residuos conservados se resaltan en amarillo cuando se usa el sitio activo de la celulosa sintasa bacteriana BcsA (a) como referencia. a–f, superposición de dominios catalíticos GT de glicosiltransferasas unidas a la membrana: celulosa sintasa bacteriana BcsA (a; PDB ID: 4hg6), β-1,3-glucano sintasa FKS1 (b), celulosa sintasa vegetal CesA (c; PDB ID : 6wlb), hialuronano sintasa de virus (d; PDB ID: 7sp7), Agrobacterium curdlan sintasa (e; modelo de AlphaFold Database; Uniprot ID: Q9X2V0), manosiltransferasa archaeal PcManGT (f; PDB ID: 6YV8). Los paneles delineados por el cuadro azul (a-e) son polisacáridos sintasas unidos a la membrana que contienen un pliegue similar a la celulosa sintasa, como se muestra en la Fig. 2f-m. PcManGT (panel f) contiene la mitad del túnel de membrana de BcsA, y se propuso tener un pliegue mínimo similar a la celulosa sintasa35. g–i, Superposición de dominios catalíticos GT de glicosiltransferasas solubles: GalNAc-T7 humana (g; PDB ID: 6iwr), S. aureus TarP (h; PDB ID: 6h4m), B. subtilis SpsA (i; PDB ID: 1qgq ).

a, Una micrografía crio-EM representativa de FKS1 S643P de 9623 micrografías recopiladas. b, Promedios representativos de clase 2D. c, Diagrama de flujo de adquisición de datos crio-EM y procesamiento de datos de FKS1 S643P. Ver Métodos para más detalles. d, la curva de correlación de capa de Fourier estándar de oro (FSC) del mapa reconstruido. e, La curva FSC entre el modelo y el mapa, que se calcula mediante PHENIX.mtriage58. f, Vistas en corte de la distribución angular de todas las partículas utilizadas en la reconstrucción 3D final. g, Distribución de resolución local del mapa crio-EM final de FKS1 S643P, calculado con ResMap. h, ajuste del mapa crio-EM con el modelo FKS1 S643P en regiones de ejemplo.

a, Análisis del fenotipo resistente a caspofungina de la cepa de S. cerevisiae con mutaciones FKS1 indicadas. Las concentraciones de caspofungina probadas se indican en la parte superior. b, Estructura química de cuatro tipos de fármacos de equinocandina. Todos cuentan con una cola de lípidos como se destaca en el recuadro. c, Estructura química de las cadenas de alquilo de lípidos (panel izquierdo) y fosfolípido (panel derecho) identificados a partir de la estructura de FKS1.

a—c, la estructura de FKS1 está coloreada según el nivel de conservación de la secuencia (rojo, alto; azul, bajo). a–b, Vista posterior y frontal paralelas a la membrana, en dibujos animados. c, La misma vista que (b) con representación de superficie.

Este archivo contiene las transferencias sin recortar (Fig. 1 complementaria) y la alineación de secuencias múltiples de ortólogos de FKS de varios hongos patógenos y Saccharomyces cerevisiae (Fig. 2 complementaria).

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Reimpresiones y permisos

Hu, X., Yang, P., Chai, C. et al. Conocimientos estructurales y mecanísticos de la β-1,3-glucano sintasa fúngica FKS1. Naturaleza 616, 190–198 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05856-5

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Recibido: 29 de marzo de 2022

Aceptado: 16 febrero 2023

Publicado: 22 de marzo de 2023

Fecha de emisión: 06 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05856-5

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